王婭寧　李淑娟

摘要：融合標(biāo)簽技術(shù)是一種基于報(bào)告基因的重組DNA技術(shù)，融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化、固定及檢測(cè)更加快速、簡(jiǎn)便，并很快得到了應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：融合標(biāo)簽技術(shù)；重組蛋白；應(yīng)用

融合標(biāo)簽技術(shù)是20世紀(jì)末興起的一種基因重組技術(shù)，其主要過(guò)程是利用重組DNA技術(shù)在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標(biāo)簽的編碼基因，通過(guò)適宜的宿主來(lái)表達(dá)重組蛋白質(zhì)[1]，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以通過(guò)融合的標(biāo)簽與包被在固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合而進(jìn)行純化。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化更加快速、簡(jiǎn)便。近幾年，隨著新的融合標(biāo)簽系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質(zhì)純化外，還用于蛋白質(zhì)定位和檢測(cè)等。

1 融合標(biāo)簽的種類

融合標(biāo)簽根據(jù)其分子量大小可分為兩大類：大的蛋白質(zhì)分子（或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其衍生物）和小的多肽片段。大的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）、SPA（葡萄球菌蛋白A）和GFP（綠色熒光蛋白）等，它的使用會(huì)增加目標(biāo)蛋白的溶解性，但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過(guò)程中，標(biāo)簽必須去除。小的多肽標(biāo)簽有6×His（六聚組氨酸）、HA（流感病毒血凝素表位）、c-myc（人c-myc蛋白表位）、FLAG（專為蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽）等，多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，因而多肽標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。迄今為止，已有文獻(xiàn)較為詳盡地報(bào)道了各種融合標(biāo)簽[2]，其大小從幾個(gè)氨基酸到蛋白質(zhì)不等，相互作用類型包括酶與底物，細(xì)菌受體與血清蛋白，六聚組氨酸與金屬離子，抗原與抗體等[3]，表1-1列出了目前報(bào)道較多的標(biāo)簽融合系統(tǒng)。

2融合標(biāo)簽技術(shù)的應(yīng)用

2.1用于蛋白的純化。

融合標(biāo)簽技術(shù)用于重組蛋白質(zhì)純化已為大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[4]。理論上，根據(jù)親和純化原理可定向設(shè)計(jì)使目標(biāo)蛋白質(zhì)與純化基質(zhì)之間不發(fā)生任何直接相互作用的融合標(biāo)簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質(zhì)變性。目前已有許多不同的標(biāo)簽可供利用。它們利用了標(biāo)簽與固相配體間的相互作用，從而可從復(fù)雜的提取物中對(duì)標(biāo)簽融合蛋白進(jìn)行選擇性的結(jié)合和洗脫。目前常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST，His和表位標(biāo)簽。

最常用的標(biāo)簽是多聚組氨酸，即His標(biāo)簽。該標(biāo)簽由6-10個(gè)連續(xù)組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標(biāo)簽與其它標(biāo)簽相比有很多明顯優(yōu)勢(shì)：①對(duì)金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力；②與金屬離子的結(jié)合不受變性劑（尿素、胍）的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(zhì)(Ni-NTA-Agarose, Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標(biāo)簽的單抗或多抗也被應(yīng)用于His融合蛋白的純化。

GST標(biāo)簽是用來(lái)從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中純化蛋白較為成功的標(biāo)簽之一。在該系統(tǒng)中，GST與被標(biāo)記的蛋白進(jìn)行融合，融合后的蛋白可在許多表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。GST和谷胱甘肽緊密結(jié)合，融合蛋白可通過(guò)谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結(jié)合的蛋白后，結(jié)合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進(jìn)行洗脫。該系統(tǒng)中被融合的目標(biāo)蛋白?？烧_的折疊成為有功能的區(qū)域，故十分有用。該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可快速、溫和地純化，配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標(biāo)簽（HA、c-myc和FLAG等）也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對(duì)表位標(biāo)簽的單克隆抗體。為使標(biāo)簽在純化中發(fā)揮良好的作用，在純化過(guò)程中應(yīng)盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標(biāo)簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發(fā)生不可逆變性，目標(biāo)蛋白的回收率低。用游離多肽競(jìng)爭(zhēng)洗脫法洗脫結(jié)合在固相抗體上的標(biāo)簽融合蛋白，是優(yōu)選的方法。目前，HA，微管蛋白標(biāo)簽[5]、KT3標(biāo)簽（SV40大T抗原的羧基末端）[6]和FLAG等已成功的用多肽洗脫方法進(jìn)行了蛋白純化。

2.2用于蛋白質(zhì)固定和檢測(cè)。

闡明蛋白質(zhì)之間的相互作用，描繪出蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖譜是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用已有很多成熟的技術(shù)平臺(tái)，如生物芯片以及基于表面等離子體共振原理的BIAcore系統(tǒng)。這些技術(shù)的關(guān)鍵步驟是將某種生物分子（蛋白質(zhì)、核酸等）固定在固相基質(zhì)上。利用融合標(biāo)簽與其配基之間的相互作用可較好地將蛋白固定在固相載體表面。融合標(biāo)簽通常是一些小的短肽分子或蛋白質(zhì)，這些標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白質(zhì)與固相基質(zhì)之間起到了一種間隔臂(spacer arm)的作用，極大程度地減少了目標(biāo)蛋白質(zhì)與固相基質(zhì)直接接觸的機(jī)會(huì)，同時(shí)由于融合標(biāo)簽通常位于融合蛋白質(zhì)的N端或C端，從而可使其活性中心充分展露，形成一種均質(zhì)配基表面，而這種均質(zhì)表面的形成對(duì)于生物芯片以及基于BIAcore系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)成功非常關(guān)鍵。不同融合標(biāo)簽系統(tǒng)的使用將為蛋白質(zhì)的定向固定提供多種多樣的選擇。

用于蛋白檢測(cè)的標(biāo)簽種類較多，其中熒光標(biāo)簽和表位標(biāo)簽最為常用，前者可在活細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，后者可用于細(xì)胞染色、免疫沉淀以及免疫印記中蛋白檢測(cè)。熒光蛋白標(biāo)簽可對(duì)融合蛋白在活細(xì)胞中適時(shí)檢測(cè)，在研究蛋白定位及其動(dòng)態(tài)變化時(shí)具有特別重要的意義。最近開(kāi)發(fā)出更多活性較強(qiáng)的標(biāo)簽以及發(fā)出不同顏色的各種熒光標(biāo)簽，極大地?cái)U(kuò)大了熒光蛋白標(biāo)簽的使用范圍[7]。采用抗GFP抗體可將該標(biāo)簽用于細(xì)胞染色、免疫沉淀以及免疫印記技術(shù)中，但是，與分子質(zhì)量較小的表位標(biāo)簽相比，分子質(zhì)量較大的標(biāo)簽，可能更容易對(duì)目標(biāo)蛋白的調(diào)節(jié)和功能產(chǎn)生影響。

2.3融合標(biāo)簽技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

融合標(biāo)簽可提高重組蛋白的產(chǎn)量，由于外源蛋白質(zhì)對(duì)于宿主菌的異質(zhì)性，當(dāng)外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，宿主菌會(huì)調(diào)動(dòng)各種機(jī)制來(lái)阻止外源蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致的直接后果就是我們所需要的目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量降低。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源蛋白質(zhì)融合某些特定的標(biāo)簽后，能夠有效增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[8]。

融合標(biāo)簽還可增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性，外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)大多以包涵體形式存在[9]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質(zhì)。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，但這種方法并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都有效。研究發(fā)現(xiàn)，一些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其它蛋白質(zhì)融合后會(huì)促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)，如MBP等[10]。Invitrogen公司在2004年開(kāi)發(fā)了一種新型的增強(qiáng)可溶性表達(dá)的多肽標(biāo)簽(SET-tag)，該標(biāo)簽是通過(guò)靜電排斥來(lái)防止新生多肽相互聚集[11]。

3 展望

親和標(biāo)簽在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中有重要作用，可以幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)和提高蛋白溶解性。親和層析得到蛋白質(zhì)純度可達(dá)90-99%。純化系統(tǒng)的選擇取決于蛋白質(zhì)性質(zhì)及下游應(yīng)用。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的融合標(biāo)簽系統(tǒng)不斷被發(fā)現(xiàn)，極大地豐富了融合標(biāo)簽的功能。不同融合標(biāo)簽系統(tǒng)有其共性，同時(shí)也有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。融合標(biāo)簽系統(tǒng)的選擇受到很多因素制約，如融合標(biāo)簽系統(tǒng)的純化條件、融合蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)（pI、細(xì)胞定位等）、純化基質(zhì)及緩沖液成本、融合標(biāo)簽的可去除性等。綜合考慮融合標(biāo)簽的各種制約因素，尚沒(méi)有一種標(biāo)簽可以滿足所有應(yīng)用的需要。因而，兩種甚至多種不同融合標(biāo)簽的組合使用將成為未來(lái)融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

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