摘要 微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中固體培養(yǎng)基的滅菌至關(guān)重要，為了解決實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題，文章基于高壓蒸汽滅菌器，對(duì)固體培養(yǎng)基滅菌過程中的排氣方式、封口方式、滅菌時(shí)間進(jìn)行了改良優(yōu)化，總結(jié)對(duì)比歸納出了一套效率高、保存時(shí)間長、重復(fù)性好的滅菌方案。該滅菌方式不僅適用于本科生教學(xué)實(shí)驗(yàn)，還適用于醫(yī)學(xué)等科研類實(shí)驗(yàn)室，并能夠?yàn)樘岣邔?shí)驗(yàn)室滅菌效率、改善本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果和提升專業(yè)人才培養(yǎng)質(zhì)量提供新思路。

關(guān)鍵詞 微生物實(shí)驗(yàn)；固體培養(yǎng)基；高壓蒸汽滅菌；人才培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2025.07.025

微生物培養(yǎng)基的制備和滅菌是保障微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)順利開展的基礎(chǔ)，該技術(shù)不僅被廣泛應(yīng)用于科研與教學(xué)領(lǐng)域，還是醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)類院校為本科生和研究生普遍開設(shè)的實(shí)驗(yàn)課程的內(nèi)容。培養(yǎng)基是微生物實(shí)驗(yàn)室最常用的微生物培養(yǎng)、分離與鑒別基質(zhì)[1]，其最有效的滅菌方式為高溫高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌器作為微生物實(shí)驗(yàn)室中常用的滅菌設(shè)備，主要用于對(duì)實(shí)驗(yàn)器械、實(shí)驗(yàn)器具及培養(yǎng)基等進(jìn)行濕熱滅菌，其滅菌效果直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。經(jīng)調(diào)研，培養(yǎng)基的pH 值、成分、顆粒大小、泡沫多少會(huì)直接影響高壓蒸汽滅菌效果[2]。此外，在滅菌方式方面，滅菌時(shí)間、溫度、壓力、蒸汽飽和度及裝載方式也會(huì)影響培養(yǎng)基的滅菌效果[3-4]，而分裝容器并不影響滅菌效果[5]。為了能讓學(xué)生在兩個(gè)學(xué)時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)過程并且能掌握實(shí)驗(yàn)原理與方法，本文根據(jù)以上調(diào)研結(jié)果進(jìn)行了多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，最后確定了一套有效的固體培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌方案：即0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃，自動(dòng)排氣，單層封口膜加報(bào)紙封口，滅菌40 分鐘，在保證固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分無顯著改變的基礎(chǔ)上，大大提高了滅菌效率，延長了固體培養(yǎng)基的保存時(shí)間。本研究結(jié)果縮短了滅菌周期、降低了實(shí)驗(yàn)成本，并提升了滅菌效果，其方法可在高校及研究所普及開展。在教學(xué)上，改良后的滅菌方案保證了教學(xué)的統(tǒng)一性和準(zhǔn)確性，提升了該課程的教學(xué)質(zhì)量和教學(xué)效能；在人才培養(yǎng)上，提高了學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中提出問題、發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力，增強(qiáng)其專業(yè)實(shí)驗(yàn)技能，為未來專業(yè)人才儲(chǔ)備夯實(shí)了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問題

微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中通過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備和滅菌使得學(xué)生充分了解高壓蒸汽滅菌器的工作原理、方法及應(yīng)用等，掌握培養(yǎng)基制備流程及儀器操作方法。然而由于教學(xué)教材、條件、設(shè)備與時(shí)間的限制，在日常實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，常常存在以下困難與問題。

1.1 培養(yǎng)基染菌問題

培養(yǎng)基的制備和滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)課程中通常以4 個(gè)學(xué)時(shí)分配到兩周內(nèi)開展，第一周開展“培養(yǎng)基的制備和滅菌”課程，制備好的培養(yǎng)基在第二周“環(huán)境條件對(duì)微生物生長的影響”課程中使用。以每周8 個(gè)行政班級(jí)240 余位學(xué)生為授課對(duì)象，每次將要制備60 瓶200 mL 的培養(yǎng)基，然而低溫冰箱中難以同時(shí)容納大量的固體培養(yǎng)基，加之實(shí)驗(yàn)室中環(huán)境復(fù)雜，菌種較多，培養(yǎng)基如果滅菌不徹底，極易交叉染菌，這不僅會(huì)造成試劑浪費(fèi)、污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，還會(huì)耽誤課程時(shí)間，影響實(shí)驗(yàn)效果和進(jìn)程。

1.2 高壓蒸汽滅菌器的使用問題

安全問題：該儀器本身內(nèi)部壓力大、溫度高，屬于燙傷、爆炸等安全隱患易發(fā)儀器。然而在實(shí)驗(yàn)室中其使用較為普遍，本教學(xué)的開展也是為了讓學(xué)生在使用該儀器時(shí)具備安全意識(shí)，并規(guī)范該儀器的操作與使用。因此高壓蒸汽滅菌器必須在學(xué)生完成具體、專業(yè)的培訓(xùn)后才能使用，且使用過程中必須有實(shí)驗(yàn)老師監(jiān)督完成各項(xiàng)操作，避免造成安全事故。

時(shí)間問題：以本實(shí)驗(yàn)室的高壓蒸汽滅菌器為例，完成一次滅菌大概需要2 小時(shí)，而該課程僅兩個(gè)學(xué)時(shí)（1.5 小時(shí)），從課程講授、培養(yǎng)基制備到高壓蒸汽滅菌，時(shí)間顯然是不充足的。因此在以往的教學(xué)中，由教師對(duì)學(xué)生配備的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作，學(xué)生沒有獨(dú)立操作，其無法掌握高壓蒸汽滅菌器的使用規(guī)范和方法。此外，如果培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌，將會(huì)耗費(fèi)更多的時(shí)間，且影響第二周實(shí)驗(yàn)課程的使用。

滅菌參數(shù)設(shè)置問題：高壓蒸汽滅菌器各方面的條件設(shè)定都影響著最終的滅菌效果，因此需要嚴(yán)格把控操作規(guī)范和程序設(shè)定以確保滅菌的有效性。以實(shí)驗(yàn)教材為準(zhǔn)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制為棉塞封口、高壓蒸汽滅菌30 分鐘。然而棉塞是傳統(tǒng)封口方式，有以下缺點(diǎn)：脫落的棉絮會(huì)污染培養(yǎng)基；定形性不好，密封不嚴(yán)密易染菌；在使用過程中無法灼燒滅菌。總結(jié)而言，其使用不太方便。教材中針對(duì)滅菌的排氣方式未加強(qiáng)調(diào)，且多次實(shí)驗(yàn)中滅菌30 min 仍然經(jīng)常出現(xiàn)染菌情況。因此，本文以此為切入點(diǎn)，針對(duì)封口方式、排氣方式和滅菌時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)調(diào)整，并將固定的滅菌方式應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)教學(xué)當(dāng)中，以達(dá)到更好的滅菌效果。

1.3 學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能培養(yǎng)問題

在以往的教學(xué)中，為了避免出現(xiàn)安全事故，要求學(xué)生將培養(yǎng)基配制完成后，將未滅菌的培養(yǎng)基交給實(shí)驗(yàn)教師滅菌，導(dǎo)致學(xué)生無法在課程中完全掌握培養(yǎng)基滅菌的要領(lǐng)，例如培養(yǎng)基配備中的封口方式、pH 值、泡沫多少，在滅菌過程中的滅菌時(shí)間、溫度、壓力、蒸汽飽和度及裝載方式等都決定了滅菌的效果。按照本文的方法改良后，可在實(shí)驗(yàn)課程的前期理論講解環(huán)節(jié)將這些滅菌的細(xì)節(jié)悉數(shù)告知學(xué)生，并分組對(duì)學(xué)生進(jìn)行滅菌鍋的操作培訓(xùn)，以提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)實(shí)操能力、細(xì)節(jié)把控能力和問題解決能力。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-50KBS），培養(yǎng)箱（博迅醫(yī)療生物儀器有限公司），牛肉膏（批號(hào)：20210120，貨號(hào)：01-009）、蛋白胨（批號(hào)： 20220322，貨號(hào)：01-001），均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，瓊脂粉（批號(hào)：20240618，貨號(hào)：507V025），購自北京索萊寶科技有限公司。

1 L牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，瓊脂20g，水1 L，pH：7.2―7.4。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)按照控制變量的方法設(shè)定不同的高溫高壓蒸汽滅菌條件，0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃ 溫度保持不變，統(tǒng)一使用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基溶解均勻后每瓶200 mL 分裝于500 mL 錐形瓶進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。為避免滅菌實(shí)驗(yàn)過程中其他因素的干擾，在條件優(yōu)化過程中采用統(tǒng)一的裝載方式和分裝容器，從而確保每次實(shí)驗(yàn)變量單一。此外，滅菌之后培養(yǎng)基的存放環(huán)境也非常重要，溫度、濕度等環(huán)境條件的變化都會(huì)影響培養(yǎng)基的保存，因此該研究將滅菌后的培養(yǎng)基保存在固定溫度28 ℃，濕度10%―20%的培養(yǎng)箱中，逐日觀察記錄一周內(nèi)的染菌情況，如果培養(yǎng)基沒有變化，說明滅菌效果良好，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)了雜菌菌落，則說明滅菌不徹底[6]，從而確定最優(yōu)的滅菌條件。

3 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)內(nèi)容及結(jié)果分析

3.1 滅菌排氣方式的改進(jìn)

有研究表明，天然培養(yǎng)基應(yīng)在高壓滅菌后自動(dòng)排氣，滅菌效果較好[7]。自動(dòng)排氣為將固體培養(yǎng)基在高壓滅菌30 分鐘后，放置待蒸汽鍋?zhàn)匀焕鋮s，壓力降至外界大氣壓時(shí)，取出培養(yǎng)基；手動(dòng)排氣為將固體培養(yǎng)基在高壓滅菌30分鐘后，立即緩慢放氣，使蒸汽鍋內(nèi)壓力降至外界壓力，取出培養(yǎng)基，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱，逐日觀察記錄一周內(nèi)的染菌情況。

實(shí)驗(yàn)效果：固體培養(yǎng)基經(jīng)手動(dòng)排氣方式滅菌后第二天已經(jīng)有染菌情況出現(xiàn)，這說明滅菌不徹底，且第六天已達(dá)到100% 染菌，與其相比，自動(dòng)排氣的滅菌效果較好（表1）。這可能是由于手動(dòng)排氣加快了滅菌的降溫降壓過程，從而縮短了高溫高壓滅菌時(shí)間；手動(dòng)排氣過程當(dāng)中滅菌鍋的密閉環(huán)境被打破，導(dǎo)致外部空氣雜菌進(jìn)入。且由于手動(dòng)排氣無法精確控制排氣量與時(shí)間，過量手動(dòng)排氣也易造成高溫蒸汽灼傷等安全隱患，因此本文選擇安全系數(shù)較高的自動(dòng)排氣，便于學(xué)生使用和操作。

3.2 封口方式的改進(jìn)

找到最佳的滅菌排氣方式之后，以自動(dòng)排氣方式滅菌，將配置好后的固體培養(yǎng)基分別用一層封口膜、雙層封口膜、雙層報(bào)紙、單層封口膜加單層報(bào)紙密封后高壓滅菌30 min，將滅菌完成的固體培養(yǎng)基置于28 ℃ 培養(yǎng)箱，逐日觀察記錄一周內(nèi)的染菌情況。

實(shí)驗(yàn)效果：如表2 顯示，報(bào)紙加一層封口膜密封的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基5 天之內(nèi)保持了零染菌，說明其滅菌效果相對(duì)最好。封口膜對(duì)培養(yǎng)物無毒害作用，可過濾灰塵，防止細(xì)菌污染，透氣性好，耐高壓，能反復(fù)使用，報(bào)紙雖然容易破損，不能重復(fù)利用，但是屬于廢物利用，更能提高滅菌效率，二者的使用均優(yōu)于傳統(tǒng)的棉塞，且方便學(xué)生操作使用，值得采用。

3.3 滅菌時(shí)間的改進(jìn)

找到最佳的滅菌排氣方式和封口方式之后，以自動(dòng)排氣方式滅菌，并用單層封口膜和報(bào)紙對(duì)錐形瓶進(jìn)行封口，分別設(shè)定20 分鐘、30 分鐘、40 分鐘及50 分鐘進(jìn)行滅菌，將滅菌完成的固體培養(yǎng)基置于28 ℃ 培養(yǎng)箱，逐日觀察記錄一周內(nèi)的染菌情況。

實(shí)驗(yàn)效果：滅菌40 分鐘在一周之內(nèi)沒有染菌情況出現(xiàn)，其滅菌效果最好，30 分鐘次之（表3）。實(shí)驗(yàn)中有趣的是，滅菌50 分鐘的滅菌效果遠(yuǎn)不如40 分鐘，這可能是由于滅菌時(shí)間過長導(dǎo)致滅菌后的固體培養(yǎng)基內(nèi)蒸氣過多，較大的濕度更易染菌。此外，長時(shí)間的高溫導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)某個(gè)或某些成分的變化，從而導(dǎo)致其更易染菌。

3.4 間歇滅菌提高滅菌效果

找到最佳的滅菌排氣方式、封口方式和滅菌時(shí)間之后，以自動(dòng)排氣方式滅菌，并用單層封口膜和報(bào)紙對(duì)三角瓶進(jìn)行封口，將121℃，40 分鐘滅菌一天后的固體培養(yǎng)基置于相同的條件重復(fù)滅菌一次，次日于相同的條件再重復(fù)滅菌一次，將滅菌完成的培養(yǎng)基置于28 ℃ 培養(yǎng)箱，逐日觀察記錄兩周內(nèi)的染菌情況。

實(shí)驗(yàn)效果：表4（p82）顯示一周內(nèi)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均無染菌，再觀察一周后，單次滅菌和重復(fù)兩次滅菌的實(shí)驗(yàn)組分別于第7 天、第11 天出現(xiàn)了染菌情況，而重復(fù)三次滅菌的實(shí)驗(yàn)組兩周內(nèi)均無染菌情況出現(xiàn)，這說明間歇重復(fù)滅菌會(huì)提高滅菌效率。有研究表明，培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌可以殺滅微生物，也會(huì)改變培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的存在形式和pH 值，而這種改變更適合于微生物的吸收和利用[8]，因此本文也進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證。在對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組無染菌的培養(yǎng)基上接種了大腸桿菌，滅菌三次的固體培養(yǎng)基上菌落的生長速度及形態(tài)與一次滅菌的培養(yǎng)基并無不同，這樣就可以重復(fù)滅菌來延長固體培養(yǎng)基的保存時(shí)間。

4 實(shí)驗(yàn)教學(xué)討論與反思

本研究對(duì)比了多個(gè)高壓蒸汽滅菌條件對(duì)微生物教學(xué)中培養(yǎng)基污染的影響，確定并優(yōu)化了固體培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌條件，即0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃，自動(dòng)排氣，單層封口膜加報(bào)紙封口，40 分鐘，在這種條件下滅菌，固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分并無改變，且提高了滅菌效率，延長了固體培養(yǎng)基的保存時(shí)間。如果需要滅菌更加徹底，保存的時(shí)間更長，可以進(jìn)行固體培養(yǎng)基重復(fù)間歇滅菌。但是這種方法的適用范圍如何還有待研究，本文僅驗(yàn)證了牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基經(jīng)間歇重復(fù)滅菌后不影響大腸桿菌的生長，由于不同實(shí)驗(yàn)室的滅菌器設(shè)施、環(huán)境及培養(yǎng)基種類不盡相同，在使用時(shí)需要進(jìn)行驗(yàn)證以確定滅菌相關(guān)參數(shù)的適用性。

該實(shí)驗(yàn)課開展的主要目的是使學(xué)生了解和掌握培養(yǎng)基制備和滅菌這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)過程。該實(shí)驗(yàn)流程較為簡單，但是高壓蒸汽滅菌器的操作有一定的難度，且學(xué)生在操作過程中很多細(xì)節(jié)難以統(tǒng)一，不好把控，原來的教學(xué)方法是由教師在實(shí)驗(yàn)課后為學(xué)生制備的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，這樣學(xué)生并不能了解滅菌實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理和操作過程，其動(dòng)手能力得不到鍛煉，知識(shí)儲(chǔ)備也跟不上。經(jīng)改進(jìn)后，首先，教師需將實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的工作原理和操作方法，以及本文的相關(guān)關(guān)鍵操作點(diǎn)、參數(shù)設(shè)置細(xì)節(jié)及相關(guān)原因等應(yīng)用多媒體教學(xué)方法進(jìn)行講解，讓學(xué)生了解并認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高學(xué)生的研學(xué)能力，加強(qiáng)研究型人才的培養(yǎng)質(zhì)量；其次，為解決學(xué)生人數(shù)較多這一難題，教師可將學(xué)生分組，并在學(xué)生使用之前以組為單位，教師親自對(duì)滅菌設(shè)備進(jìn)行操作演示，確保每個(gè)學(xué)生都能依照本文的操作方法獨(dú)立完成培養(yǎng)基的制備，從而激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手能力，以實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)。

*通信作者：史雪盟

基金項(xiàng)目：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)高等教育教學(xué)改革研究與實(shí)踐項(xiàng)目“研究型人才培養(yǎng)模式下的微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革”（2024XJGLX110）；河南省高校實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目“農(nóng)業(yè)類高校實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員隊(duì)伍建設(shè)改革與實(shí)踐”（ULAHN202361）。

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