摘要：為探究生長(zhǎng)素響應(yīng)因子NtARF2基因在調(diào)控?zé)煵葩浀奈蘸屠眠^(guò)程中的功能，將煙草K326 NtARF2的cDNA作為模板通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行克隆，利用生物信息學(xué)軟件分析其結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)亞細(xì)胞定位技術(shù)判斷其表達(dá)位置，運(yùn)用qRT-PCR等技術(shù)對(duì)NtARF2基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。結(jié)果表明，NtARF2基因全長(zhǎng)2 556 bp，可編碼851個(gè)氨基酸；NtARF2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為94.528 05 ku；理論等電點(diǎn)為6.37，酸性；不穩(wěn)定指數(shù)為55.11，屬于不穩(wěn)定蛋白，并且不包含跨膜結(jié)構(gòu)域；同源性和進(jìn)化樹(shù)分析表明，煙草NtARF2與擬南芥AtARF2同源性和親緣性較高。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白是一個(gè)核蛋白；啟動(dòng)子分析和不同脅迫（低鉀、高溫、干旱、低溫、高鹽）處理下的qRT-PCR結(jié)果顯示，NtARF2基因能夠響應(yīng)低鉀、高溫、干旱和鹽脅迫反應(yīng)，尤其是低鉀響應(yīng)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因具有組織表達(dá)特異性，且低鉀條件下煙株根、莖和葉片部位該基因表達(dá)量顯著降低，推測(cè)其參與了不同脅迫下鉀離子的吸收和再利用，且可能是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

關(guān)鍵詞：普通煙草；NtARF2基因；基因克??；表達(dá)模式；低鉀脅迫

中圖分類號(hào)：S188；S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0094-06

收稿日期：2023-12-22

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司貴州省公司重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2022XM06）。

作者簡(jiǎn)介：武博寒（2001—），女，碩士研究生，主要從事煙草生物技術(shù)研究。E-mail：18738852057@163.cm。

通信作者：賈宏昉，博士，副教授，主要從事煙草生物技術(shù)研究。E-mail：jiahongfang@126.com。

煙葉中的鉀含量是影響煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，高含量的鉀不僅可以增強(qiáng)煙葉的燃燒性和減少焦油的產(chǎn)量，對(duì)提高香氣質(zhì)和香氣量有很大幫助，并且有利于提高煙葉外觀和內(nèi)在品質(zhì)［1］。在我國(guó)，大多數(shù)煙草產(chǎn)區(qū)的煙葉鉀含量?jī)H為1.5%，這一數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于優(yōu)質(zhì)煙葉鉀含量（2%），因此，提高煙葉鉀含量是我國(guó)煙草行業(yè)發(fā)展亟需解決的問(wèn)題。植物在受到低鉀脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，例如鉀調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（WRKY、GRAS等）、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HAK、KUP等），增強(qiáng)植物對(duì)鉀離子的吸收與利用［2-6］。同時(shí)也有研究表明，植物通過(guò)調(diào)控激素信號(hào)，改變根系構(gòu)型，增加主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量，增加根系活力，以便從土壤中吸收更多的鉀元素［7］。植物激素中的生長(zhǎng)素在調(diào)控植物鉀離子吸收過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。

ARF家族基因作為一類關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄過(guò)程中調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而參與生長(zhǎng)素的信號(hào)傳遞路徑［9］。目前，對(duì)植物中的ARF基因家族的研究主要聚焦于擬南芥、水稻和番茄等作物，分別鑒定出23、25、21個(gè)，其中大部分成員的功能都與植物根、葉、花、果、種子的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。如克魯夫等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtARF2參與調(diào)控?cái)M南芥種子和花大??；王德凱等發(fā)現(xiàn)在ARF7/19通過(guò)激活LBD/ASL基因的表達(dá)調(diào)控側(cè)根發(fā)育，且兩者之間存在功能冗余；劉松瑜等發(fā)現(xiàn)番茄SIARF12基因負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)膨大；水稻OSARF1基因在調(diào)控植株的生長(zhǎng)速率、葉片大小和植株矮化程度上起到了關(guān)鍵作用［10-16］。同時(shí)存在少部分成員參與植物逆境脅迫響應(yīng)，如Bouzroud等發(fā)現(xiàn)通過(guò)運(yùn)用CRISPR/Cas技術(shù)下調(diào)或喪失番茄SIARF4基因均能提高番茄對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［17］；趙帥等發(fā)現(xiàn)AtARF2在低鉀條件下減輕了鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HAK5轉(zhuǎn)錄的抑制［18］；ZmARF2具有與玉米ZMHAK家族中的ZMHAK1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的能力，并且能夠?qū)τ衩字锈浀奈蘸屠眠M(jìn)行調(diào)控［19］。

目前研究已發(fā)現(xiàn)煙草中有46個(gè)ARF家族成員存在，這些基因參與了煙草生長(zhǎng)及生理代謝相關(guān)功能的調(diào)節(jié)，然而在煙草中，ARF家族基因?qū)τ阝浽跓煵葜形辙D(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，克隆ARF家族的NtARF2基因，對(duì)其采用生物信息學(xué)軟件、qRT-PCR和亞細(xì)胞定位等多種技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在進(jìn)一步探究出NtARF2基因響應(yīng)非生物脅迫的功能［20］。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為K326。將種子置于避光環(huán)境下萌發(fā)3 d，同時(shí)環(huán)境溫度設(shè)置為28 ℃，后將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至人工氣候箱內(nèi)，培養(yǎng)箱內(nèi)白天和夜晚的交替周期、光照度、溫度、相對(duì)濕度分別設(shè)置為 16 h—8 h（光—暗）、300 μmol/（m2·s）、28 ℃—22 ℃（光—暗）、60%。

具體操作方法：在種子露白后，先用1/4霍格蘭培養(yǎng)液（以下以正常營(yíng)養(yǎng)液代稱）進(jìn)行3 d的水培培養(yǎng)，再換為1/2正常營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行3 d的培養(yǎng)，最后換為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)完成后對(duì)煙苗進(jìn)行低鉀（0.1 mmol/L K+處理7 d）、高鹽（150 mmol/L NaCl處理7 d）、干旱（10%的PEG-6000處理7 d）、高溫（45 ℃處理6 h）和低溫（4 ℃處理3 h）處理。在處理完成之后，選擇3株生長(zhǎng)狀態(tài)一致的煙苗，用蒸餾水進(jìn)行清洗后，分別提取各樣品的根、莖和葉，用于檢測(cè)NtARF2基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年7月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草營(yíng)養(yǎng)高效育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 目的基因克隆

對(duì)煙草葉片進(jìn)行總RNA的提取，并對(duì)提取產(chǎn)物進(jìn)行D260 nm/280 nm比值的測(cè)定判斷其純度，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定，后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)所需引物，以煙草葉片cDNA為模版，采用標(biāo)準(zhǔn)的 20 μL PCR反應(yīng)體系（1 μL cDNA模板，上下游引物各1 μL，PCR mix 10 μL，7 μL ddH2O），反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后設(shè)置72 ℃保溫 5 min，克隆獲得全長(zhǎng)基因后交由武漢伯遠(yuǎn)公司負(fù)責(zé)測(cè)序驗(yàn)證工作。

1.4 序列分析方法

通過(guò)BioEdit軟件進(jìn)行NtARF2基因序列蛋白翻譯；通過(guò)NetPhos 2.0 Serve對(duì)NtARF2蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；通過(guò)TMHMM 2.0線上預(yù)測(cè)NtARF2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；通過(guò)DNAMAN將NtARF2與擬南芥、玉米、水稻等其他植物進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)；通過(guò)MEGA 6.0軟件對(duì)比NtARF2與其他物種ARF家族成員進(jìn)行親緣關(guān)系分析以構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［21］。

1.5 啟動(dòng)子分析

以煙草NtARF2基因全長(zhǎng)序列為探針，使用Sol Genomics Network網(wǎng)站上的Blast工具進(jìn)行基因全長(zhǎng)序列的檢索，后選取起始密碼子上游長(zhǎng)度為 2 000 bp 的序列，并將其提交到Plant CARE網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件在線分析。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

將無(wú)末端密碼子的NtARF2 cDNA融合到pBWA（V）HS載體中GFP基因的N末端，構(gòu)建目的基因表達(dá)載體pBWA（V）HS-NtARF2-GLosgfp，采用注射法導(dǎo)入煙草葉片，用35S：：GFP對(duì)對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行同樣的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后在黑暗條件下25 ℃放置16 h。之后使用共聚焦顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察并記錄綠色熒光蛋白（GFP）信號(hào)的即時(shí)表達(dá)情況［22］。

1.7 基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，將GenBank：L18908.1-NtL25基因作為內(nèi)參基因，試驗(yàn)重復(fù)3次以確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，使用公式2-ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)量。綜合數(shù)據(jù)與分析結(jié)果運(yùn)用GraphPad作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtARF2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度在2 000～3 000 bp 范圍內(nèi)。進(jìn)一步對(duì)克隆出的NtARF2基因進(jìn)行測(cè)序分析，其全長(zhǎng)2 556 bp，可編碼851個(gè)氨基酸，將其測(cè)序結(jié)果與NCBI上的NtARF2基因參考序列（XM_016621326.1）進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的核苷酸序列完全吻合，具有100%的相似性，這表明克隆得到的序列是NtARF2基因CDS序列。

2.2 NtARF2蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果

NtARF2可編碼851個(gè)氨基酸，分子式為 C4 134H6 478N1 184O1 294S33，分子量為94.528 05 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為6.37，顯示該蛋白呈酸性；不穩(wěn)定指數(shù)（Ⅱ）為55.11，屬于不穩(wěn)定蛋白。對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)由4種不同組件構(gòu)成，包括 α-螺旋、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊，各部分占比不同，分別為24.91%、19.51%、46.18%和9.40%。進(jìn)一步對(duì)NtARF2蛋白序列進(jìn)行分析，該

蛋白共包含72個(gè)絲氨酸、26個(gè)蘇氨酸和5個(gè)酪氨酸，推測(cè)以上一些位點(diǎn)可能會(huì)發(fā)生磷酸化。

2.3 NtARF2蛋白的氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

由圖2可知，煙草NtARF2與擬南芥AtARF2、玉米ZmARF2和水稻OsARF2的同源性分別為61.87%、25.32%和52.16%。利用MEGA分析其親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）顯示，NtARF2與擬南芥AtARF2位于同一進(jìn)化分支，同源性較高，推測(cè)兩者可能具有相似的功能。

2.4 NtARF2基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件分析結(jié)果

由圖4可知，除了包含啟動(dòng)子所必需的 TATA-box和CAAT-box外，NtARF2啟動(dòng)子區(qū)域還具有可以與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子結(jié)合后調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào)的元件，即TGA-element；同時(shí)存在多個(gè)與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（LTR和MBS）以及與防御和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)元件（TC-rich repeats），這些元件有助于提高植物在脅迫中的抵抗力；此外還包含與植物激素脫落酸，茉莉酸甲酯相關(guān)元件（ARBE和MeJA）。

2.5 NtARF2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果

通過(guò)NtARF2蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果（圖5）觀測(cè)到綠色熒光信號(hào)僅出現(xiàn)在細(xì)胞核中，并且與核定位標(biāo)記蛋白的位置完全一樣，這一現(xiàn)象表明NtARF2蛋白為核蛋白?；谶@一發(fā)現(xiàn)，推測(cè)NtARF2可能作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.6 NtARF2基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)水平分析結(jié)果

為了解NtARF2基因在非生物脅迫條件下的反

應(yīng)，以未經(jīng)脅迫處理的植株為對(duì)照，觀測(cè)不同非生物脅迫下的NtARF2基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示，NtARF2基因在低鉀、高溫、干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照，在低溫條件下，NtARF2的表達(dá)水平與對(duì)照之間無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）。這表明NtARF2基因在煙草植株對(duì)低鉀、高溫、干旱和高鹽脅迫的反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用，其中低鉀脅迫下NtARF2基因的表達(dá)水平與對(duì)照差異最為顯著。

2.7 低鉀脅迫下NtARF2基因的表達(dá)水平分析結(jié)果

為進(jìn)一步研究NtARF2基因的表達(dá)特性，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了NtARF2基因在低鉀處理（0.1 mmol/L K+）和正常供鉀條件（2 mmol/L K+，對(duì)照）下不同組織中的相對(duì)表達(dá)量（圖7）。正常供鉀和低鉀處理?xiàng)l件下的NtARF2基因在煙草的根、莖、葉中都有所表達(dá)，但在根和莖中的表達(dá)水平相對(duì)較高，葉片中略低，這表明NtARF2基因存在明顯的組織表達(dá)特異性。并且在低鉀脅迫處理下，煙草根、莖和葉中NtARF2基因的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照水平，推測(cè)該基因可在煙草中起到一個(gè)負(fù)調(diào)控的作用。

3 討論

本研究從煙草K326中克隆出NtARF2基因并鑒定分析了煙草NtARF2基因，該基因全長(zhǎng) 2 556 bp，編碼851個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NtARF2與其他植物中ARF蛋白氨基酸序列具有高度相似性，且與擬南芥AtARF2的親緣關(guān)系最近，推測(cè)二者在功能上有可能相似。

ARF基因在多種植物中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們不僅參與到相關(guān)植物激素響應(yīng)中，而且還與植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫相關(guān)，這些基因的表達(dá)和調(diào)控對(duì)于植物的生長(zhǎng)以及逆境生存具有非常重要的意義。高鹽和干旱條件下，番茄ARF4在脈管系統(tǒng)和氣孔中降低表達(dá)通過(guò)增加根生長(zhǎng)和密度以及增加糖含量和葉綠素含量而提高對(duì)鹽和干旱的耐受性［24］。也有研究表明番茄ARF4能夠通過(guò)下調(diào)來(lái)改變植物生長(zhǎng)、氣孔功能提高番茄對(duì)鹽度和滲透脅迫的耐受性［25］。ARF轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化來(lái)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育［26］。植物在脅迫下會(huì)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄因子）對(duì)此做出相應(yīng)變化［27］。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解轉(zhuǎn)錄因子如何精準(zhǔn)調(diào)控下游基因表達(dá)的機(jī)制提供了有力的科學(xué)依據(jù)。

為了進(jìn)一步研究NtARF2基因在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)水平，本研究檢測(cè)了NtARF2基因在低鉀、低溫、干旱、高鹽和高溫脅迫條件下的表達(dá)水平，結(jié)果推測(cè)NtARF2基因參與了非生物脅迫鉀離子的吸收和再利用過(guò)程。通過(guò)進(jìn)一步分析NtARF2基因在低鉀條件下的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因在低鉀條件下表達(dá)水平顯著降低，且不同部位表達(dá)水平也顯著不同，這也表明該基因在不同組織中的表達(dá)存在特異性。前人的研究表明，ARF家族成員可以調(diào)控下游的靶基因，參與各種生物與非生物脅迫［28］。趙帥等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，AtARF2基因可以通過(guò)調(diào)控下游HAK5基因的表達(dá)從而調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鉀的吸收與利用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，NtARF2基因在高溫和高鹽條件下，表達(dá)水平極顯著降低，故推測(cè)NtARF2基因在該條件下可能涉及到某些分子機(jī)理去應(yīng)對(duì)脅迫。因此在接下來(lái)的研究中，可以通過(guò)構(gòu)建突變體和過(guò)表達(dá)材料，酵母單雙雜和BiFC技術(shù)去確定NtARF2基因的下游靶基因，同時(shí)結(jié)合生理指標(biāo)測(cè)定，明確NtARF2基因在高溫或者高鹽脅迫下如何調(diào)控鉀吸收與利用的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

在煙草中克隆NtARF2基因，通過(guò)對(duì)NtARF2的同源性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白為核蛋白。啟動(dòng)子分析和不同脅迫（低鉀、高溫、干旱、低溫、高鹽）處理下的qRT-PCR結(jié)果顯示，NtARF2基因能夠響應(yīng)低鉀、高溫、干旱和鹽脅迫反應(yīng)，尤其是低鉀響應(yīng)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因具有組織表達(dá)特異性，且低鉀條件下煙株根、莖和葉片部位該基因表達(dá)量顯著降低，推測(cè)其參與了不同脅迫下鉀離子的吸收和再利用，且可能是一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。

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