摘要：為了探究鐵皮石斛（Dendrobium officinale）DobHLH74基因的生物學(xué)特性和抗逆功能，利用同源克隆技術(shù)獲得廣東丹霞鐵皮石斛DobHLH74基因的完整cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)特性分析。結(jié)果顯示，DobHLH74（GenBank登錄號(hào)：PP534457）開放讀碼框全長(zhǎng)996 bp，編碼331個(gè)氨基酸殘基；其蛋白質(zhì)理論分子量為36.557 ku，理論等電點(diǎn)為5.53，表明其為親水性不穩(wěn)定蛋白；具有bHLH_SF保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH超家族，且無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)域，符合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征；與金釵石斛（Dendrobium nobile）親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)97.22%。DobHLH74基因具有組織表達(dá)特異性，在葉組織中表達(dá)量顯著高于其他組織，可能參與碳源調(diào)控過(guò)程。DobHLH74的啟動(dòng)子具有與低溫、干旱、鹽堿響應(yīng)和ABA應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，且在低溫、干旱和ABA脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)；與未處理相比，DobHLH74基因在低溫和干旱處理6 h后表達(dá)量分別提高93.78倍和5.91倍，在ABA處理9 h后表達(dá)量是未處理的20.90倍，推測(cè)該基因在轉(zhuǎn)錄水平上可能通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與低溫和干旱脅迫響應(yīng)，研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘DobHLH74基因功能及其在非生物脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；DobHLH74基因；同源克隆；表達(dá)分析；非生物脅迫

中圖分類號(hào)：S188；S567.23+9.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0262-08

收稿日期：2024-04-06

基金項(xiàng)目：廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（編號(hào)：2024A1515013167）；廣東省普通高校重點(diǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)（編號(hào)：2022ZDZX4044、2024ZDZX2023）；黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：LH2021E091）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)教師“創(chuàng)新”項(xiàng)目支持計(jì)劃（編號(hào)：XL0063）。

作者簡(jiǎn)介：葛秀麗（1996—），女，安徽阜陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)殍F皮石斛分子分析與基因改良。E-mail：984239190@qq.com。

通信作者：崔 迪，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)，E-mail：jscz_dd@hotmail.com；劉羽佳，博士，副教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锬婢成砼c分子生物學(xué)，E-mail：liuyj1206@sgu.edu.cn。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生草本植物，因其悠久的藥用歷史和豐富的藥理活性成分而備受推崇，被譽(yù)為“藥界大熊貓”［1］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛富含苯丙氨酸，以及黃酮、聯(lián)芐與核苷類化合物等多種活性物質(zhì)，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種藥理活性，在多種疾病的預(yù)防和治療中展現(xiàn)出良好的療效［2-5］。然而，野生鐵皮石斛資源的快速減少，導(dǎo)致其瀕臨滅絕，雖然人工栽培能部分緩解資源匱乏的問(wèn)題，但由于引種不當(dāng)、栽培品種混雜、成品質(zhì)量參差不齊等原因，鐵皮石斛的藥用品質(zhì)難以得到有效保障［6-8］。

bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫中扮演著關(guān)鍵角色［9-10］。bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，由約60個(gè)氨基酸構(gòu)成，分為堿性和螺旋-環(huán)-螺旋2個(gè)功能區(qū)域，其中堿性區(qū)域負(fù)責(zé)DNA元件結(jié)合，而螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域則促進(jìn)同源和異源二聚體復(fù)合物的形成［11-12］。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫等方面的功能逐漸得以揭示［13-17］。例如，陸地棉（Gossypium hirsutum）bHLH基因（GhPAS1）能夠介導(dǎo)油菜素甾醇信號(hào)通路，調(diào)控陸地棉植株的生長(zhǎng)發(fā)育［18］；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中異源過(guò)表達(dá)鱗葉卷柏（Selaginella lepidophylla）SlbHLHopt基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株在缺水和鹽脅迫下的生存能力［19］；玉米（Zea Mays）的bHLH基因（ZmPTF1）在干旱脅迫下通過(guò)依賴于ABA（脫落酸）信號(hào)途徑促進(jìn)了根系的發(fā)育，提高了植株的抗旱性［20］。水稻（Oryza sativa）OsbHLH148基因能夠調(diào)控茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，作為干旱脅迫響應(yīng)的初始反應(yīng)因子參與干旱和創(chuàng)傷應(yīng)答過(guò)程［21］。同時(shí)，將葡萄（Vitis vinifera）VvbHLH1基因在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐寒能力［22］。在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)歐洲甜櫻桃（Prunus avium）PavbHLH28基因能夠提高脯氨酸含量，降低丙二醛含量，進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性［23］。此外，bHLH轉(zhuǎn)錄因子還參與植物對(duì)病蟲害的防御機(jī)制，通過(guò)調(diào)控?fù)]發(fā)性物質(zhì)的合成增強(qiáng)植物對(duì)害蟲的抗性。如水稻OsbHLH6基因可以通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)水楊酸和茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控植物體在感染水稻稻瘟病病菌時(shí)的防御響應(yīng)機(jī)制［24］。在百脈根（Lotus corniculatus）中同源過(guò)表達(dá)LjbHLH7基因可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性［25］。然而，鐵皮石斛作為一種重要的藥用植物，其bHLH轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下的分子遺傳機(jī)制尚未得到充分研究。因此，本研究利用同源克隆技術(shù)從廣東丹霞鐵皮石斛中克隆了DobHLH74基因全長(zhǎng)序列，分析了其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。本研究初步分析了DobHLH74基因的組織表達(dá)特性及在脅迫下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)挖掘其生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)，并為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的藥用鐵皮石斛提供基因資源，同時(shí)也為遺傳育種提供重要支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的廣東“丹霞”鐵皮石斛，由韶關(guān)市石斛工程技術(shù)中心提供。pUCm-T載體試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Mix plus、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Realab Green PCR Fast Mixture、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix均購(gòu)自北京蘭博利德生物技術(shù)有限公司；由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)引物的合成及DNA測(cè)序工作。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與方法

試驗(yàn)于2022年9月至2023年12月在廣東省韶關(guān)市韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院分子生物學(xué)與基因工程研究室進(jìn)行。

1.2.1 樣品處理 鐵皮石斛成熟蒴果經(jīng)次氯酸鈉表面消毒后播種于添加了馬鈴薯粉的培養(yǎng)基上，光照周期 16 h/d，（25±1） ℃ 恒溫培養(yǎng)約6 個(gè)月。選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)狀況良好的組培幼苗（株高5～6 cm）作為試驗(yàn)樣品。低溫處理：將組培幼苗置于 4 ℃ 恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照。干旱及ABA處理：分別用20% PEG（聚乙二醇）-6000溶液和 100 μmol/L ABA溶液澆灌幼苗，對(duì)照植株均用清水澆灌。不同處理組分別在處理后0、3、6、9、12、24 h采集葉片，液氮速凍后保存于超低溫冰箱。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品均取3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 基因克隆 采用Trizol法提取鐵皮石斛葉片總RNA，參照All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 試劑盒說(shuō)明書合成單鏈cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的鐵皮石斛DobHLH74 基因（基因ID：LOC110114258）為參考序列，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物：DobHLH74-F：5′-ATGGCAACTCCATGTTCATC-3′，DobHLH74-R：5′-CTAAATAGATAATTGATTC-3′。PCR 體系：2×Taq PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；接著進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；最后在72 ℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后回收目的片段，與pUCm-T 載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 以克隆的鐵皮石斛DobHLH74蛋白序列為基準(zhǔn)，利用NCBI-BLASTP工具篩選同源蛋白，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 11軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。為深入了解DobHLH74蛋白特性，采用 NCBI-CDD工具預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)域，利用Expasy ProtParam在線服務(wù)分析其理化性質(zhì)；分別采用SPLIT 4.0 SERVER和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)分析DobHLH74蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性。另外，使用在線程序TMHMM和SignaIP 4.1分別預(yù)測(cè)分析DobHLH74蛋白的跨膜區(qū)和信號(hào)肽；利用NetPhos 3.1在線軟件對(duì)其蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。采用New PLACE在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析DobHLH74啟動(dòng)子序列的DNA元件。所用工具的網(wǎng)址參考理雅等的研究［26］。

1.2.4 不同處理表達(dá)模式的轉(zhuǎn)錄組分析 采用Trizol 法分別提取“1.2.1”節(jié)中不同處理樣品RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，高通量測(cè)序委托深圳華大基因科技有限公司完成，使用Illumina HiSeqTM 2500/MiSeqTM 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。數(shù)據(jù)處理及分析方法參考理雅等的研究［26］?；虮磉_(dá)量以FPKM進(jìn)行量化，分析鐵皮石斛DobHLH74 基因在低溫、干旱和ABA 脅迫下的表達(dá)特性。

1.2.5 RT-qPCR表達(dá)分析 以鐵皮石斛根、莖、葉、花和“1.2.1”節(jié)中不同處理樣品cDNA 為模板，使用Primer Premier 5.0 軟件對(duì)克隆的DobHLH74 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（F：5′-AGCAACAAGTAGAGTTC-3′；R：5′-TGAGCATATGGAGTGCT-3′）；內(nèi)參基因引物（DoActin7-F：5′-CCCTACCTCCTACCTCTGCG；DoActin7-R：5′-GCAAACCCAGCCTTCACCAT-3′）。DobHLH74 基因的組織特異性表達(dá)分析和在不同脅迫下的表達(dá)分析用2-ΔΔC T 法進(jìn)行量化。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用WPS 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用GraphPad Prism 8 和SPSS 27.0 軟件進(jìn)行作圖和差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛DobHLH74 基因克隆與序列分析

以鐵皮石斛葉片cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條清晰且無(wú)雜帶的DobHLH74 基因片段（圖1-A），測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，該基因序列長(zhǎng)度為996 bp，編碼331 個(gè)氨基酸?；蚪Y(jié)構(gòu)和染色體定位分析結(jié)果顯示，DobHLH74 基因位于第7 號(hào)染色體，由8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成（圖1-B）。與參考序列（序列號(hào)：LOC110107930）存在8 個(gè)堿基差異，其中同義替換和非同義替換各4 個(gè)（圖2）。

2.2 鐵皮石斛DobHLH74蛋白理化性質(zhì)分析

DobHLH74蛋白包含1個(gè)高度保守的bHLH_SF結(jié)構(gòu)域（圖3-A），這一特征清晰地表明該基因歸屬于bHLH 超家族。蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，DobHLH74蛋白的分子式為C1 581H2 556N442O514S18，理論分子量為36.557 ku，理論等電點(diǎn)為5.53。其不穩(wěn)定指數(shù)為50.00，表明該蛋白具有親水性且不穩(wěn)定（圖3-B）。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DobHLH74二級(jí)結(jié)構(gòu)由13.60%的α-螺旋、4.83%的β-折疊以及81.57%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖3-C）；其三級(jí)結(jié)構(gòu)與建蘭（Cymbidium ensifolium）bHLH74 蛋白相似度高達(dá)81.79%（圖4-C）。另外，DobHLH74 不含信號(hào)肽（圖4-A），無(wú)跨膜區(qū)域（圖4-B），不具備分泌性。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DobHLH74 共有59 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括39 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、15 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)以及5 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)（圖4-D）。

2.3 DobHLH74 蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP工具對(duì)鐵皮石斛DobHLH74氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，挑選6 個(gè)與DobHLH74蛋白高度同源的植物bHLH蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示，金釵石斛（KAI0525262.1）與DobHLH74同源性最高，相似度為97.22%，其次是鼓槌石斛（KAH0468352.1）、建蘭（QDL88375.1）和蝴蝶蘭（XP_020573315.1），相似度分別為88.92%、81.54%、76.92%。多序列對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DobHLH74蛋白序列與多種植物的bHLH 蛋白序列在155～237 aa位置均含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，鐵皮石斛DobHLH7 蛋白與金釵石斛bHLH蛋白的親緣關(guān)系最近，聚類在同一分支（圖6）。

2.4 DobHLH74 基因組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR對(duì)鐵皮石斛DobHLH74基因的組織表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，DobHLH74在不同組織中表達(dá)水平存在顯著差異，在葉相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織，是莖表達(dá)量的28.60倍；在花和根中表達(dá)量相對(duì)較低（圖7）。表明DobHLH74基因在鐵皮石斛葉組織的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可能參與光合作用的調(diào)控過(guò)程。

2.5 DobHLH74 在非生物脅迫下的表達(dá)分析

順式作用元件分析結(jié)果顯示，DobHLH74基因

起始密碼子上游2.0 kb啟動(dòng)子序列具有多種DNA順式作用元件，主要涉及干旱及低溫響應(yīng)、鹽堿脅迫響應(yīng)和ABA響應(yīng)過(guò)程（表1）。因此，進(jìn)一步分析了DobHLH74基因在低溫、干旱以及ABA脅迫下的表達(dá)特性。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，低溫、干旱和ABA處理均能夠誘導(dǎo)DobHLH74基因表達(dá)，且該基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫處理6～9 h后達(dá)到最高（圖8）。qRT-PCR分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，與未處理時(shí)相比，DobHLH74基因在低溫和干旱處理6 h后表達(dá)量到達(dá)峰值，分別顯著提高了93.78倍和5.91倍（圖9-A和圖9-C）；在ABA處理9 h后，DobHLH74基因表達(dá)量達(dá)到最高，是未處理的20.90倍（圖9-B）。這些結(jié)果表明，DobHLH74基因在應(yīng)對(duì)非生物脅迫過(guò)程中具有重要功能，并可能參與調(diào)控植物對(duì)逆境的適應(yīng)機(jī)制。

3 討論

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的調(diào)控蛋白，通過(guò)bHLH結(jié)構(gòu)域與DNA上的元件識(shí)別互作，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的基因表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境應(yīng)答和次生代謝等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［17，19，22，27］。截至2024年，鐵皮石斛基因組中共鑒定到108個(gè)bHLH基因家族成員［28］。本研究克隆的DobHLH74基因全長(zhǎng)序列為996 bp，編碼331個(gè)氨基酸殘基，含有1個(gè)bHLH_SF保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)堿性區(qū)域，屬于非典型的bHLH蛋白。DobHLH74編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，為非分泌性蛋白，符合轉(zhuǎn)錄因子核內(nèi)定位特性。另外，DobHLH74含有59個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中39個(gè)為絲氨酸磷酸化，表明其可能為該蛋白的主要磷酸化形式。另外，DobHLH74蛋白與金釵石斛、鼓槌石斛的bHLH蛋白同源性極高，表明該基因在蘭科石斛屬植物中高度保守，可能對(duì)石斛屬植物的生存和適應(yīng)性至關(guān)重要，在石斛屬植物的演化過(guò)程中扮演著重要的功能角色。

以往研究表明，在植物中bHLH基因表達(dá)具有時(shí)空特異性［29-30］。例如，在苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中，F(xiàn)tbHLH2和FtbHLH155基因在花器官表現(xiàn)出高水平表達(dá)，而FtbHLH67和FtbHLH70基因則在果實(shí)組織中顯著表達(dá)［31］；水稻OsbHLH109基因在根、莖、葉和幼穗等組織中均有表達(dá)，但在葉片中的表達(dá)量最高［32］；在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中，MtbHLH148基因在莖組織中表現(xiàn)出高水平表達(dá)，而在葉中表達(dá)量最低［33］。本研究的結(jié)果與前述研究結(jié)果相契合，DobHLH74基因在鐵皮石斛不同組織和器官中的表達(dá)水平存在顯著差異，在葉片中的表達(dá)水平顯著高于其他組織器官，暗示該基因在光合作用中發(fā)揮功能，可能參與光合作用的碳源調(diào)控過(guò)程。此外，bHLH表達(dá)調(diào)控及其參與的信號(hào)通路在對(duì)抗低溫、干旱、高鹽等脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用［34］。例如，在擬南芥中過(guò)表達(dá)蘋果（Malus pumila）bHLH基因（MdCIB1）能夠提高脯氨酸含量，降低過(guò)氧化物積累，增強(qiáng)抗氧化酶活性，進(jìn)而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力［35］。將小麥（Triticum aestivum）TabHLH39基因在擬南芥異源表達(dá)，顯著提高了非生物脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的成活率，同時(shí)該基因增加了可溶性糖和脯氨酸含量，降低了電解質(zhì)滲漏率，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、抗鹽和抗寒性［36］?；ㄉˋrachis hypogaea）AhbHLH112基因通過(guò)調(diào)節(jié)POD（過(guò)氧化物酶）介導(dǎo)的H2O2穩(wěn)態(tài)，提高了活性氧清除能力，通過(guò)ABA依賴性脅迫響應(yīng)途徑在干旱脅迫耐受性中起積極作用［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，DobHLH74啟動(dòng)子序列具有低溫、干旱、鹽堿等多種環(huán)境脅迫的應(yīng)答元件，并在低溫、干旱和ABA脅迫時(shí)，該基因的表達(dá)量均存在顯著上調(diào)，且表達(dá)模式呈現(xiàn)出高度的一致性，提示該基因可能在轉(zhuǎn)錄水平上通過(guò)ABA信號(hào)途徑參與對(duì)低溫和干旱脅迫的應(yīng)答過(guò)程，但具體調(diào)控機(jī)制目前缺乏詳盡的解析，須要通過(guò)基因過(guò)表達(dá)或敲除等分子生物學(xué)方法和基因工程技術(shù)進(jìn)一步深入研究。這也是筆者所在課題組今后的重點(diǎn)研究方向。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了DobHLH74基因，表達(dá)特異性分析提示該基因可能參與鐵皮石斛光合作用的碳源調(diào)控過(guò)程。同時(shí)，DobHLH74基因可能通過(guò)依賴ABA信號(hào)途徑在轉(zhuǎn)錄水平上參與低溫和干旱脅迫的響應(yīng)。因此，該基因可作為候選基因，進(jìn)一步研究鐵皮石斛響應(yīng)非生物脅迫的作用機(jī)制，為鐵皮石斛抗逆性育種提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］嚴(yán) 靜，蔡易熹，陳燕蘭，等. 鐵皮石斛莖、葉、花的活性成分及綜合利用研究進(jìn)展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（17）：299-306.

［2］左佳昕，戴 鑫，何 偉，等. 鐵皮石斛保肝活性成分與作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 中草藥，2024，55（4）：1365-1376.

［3］倪 凱，何鵬飛，梁志慶，等. 鐵皮石斛化學(xué)成分、藥理作用及毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究進(jìn)展［J］. 云南中醫(yī)中藥雜志，2023，44（10）：86-93.

［4］胡 楊，趙 勉，邱雨軒，等. 藥食同源中藥鐵皮石斛的研究進(jìn)展［J］. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，40（1）：94-108.

［5］顏沛沛，葉 煒，江金蘭，等. 鐵皮石斛和重唇石斛及其雜交子代莖·葉揮發(fā)性成分分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（22）：208-212，251.

［6］黃曉君，汪志強(qiáng)，聶少平. 鐵皮石斛的功能活性研究及產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2023，23（11）：1-12.

［7］錢亦純，陸秋君，梁大剛，等. 鐵皮石斛花和葉營(yíng)養(yǎng)成分及資源開發(fā)研究進(jìn)展［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，64（12）：2891-2896.

［8］劉羽佳，陳堰珊，理 雅，等. 鐵皮石斛種質(zhì)資源與遺傳改良研究進(jìn)展［J］. 韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，43（12）：1-6.

［9］Toledo-Ortiz G，Huq E，Quail P H. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family［J］. The Plant Cell，2003，15（8）：1749-1770.

［10］Carretero-Paulet L，Galstyan A，Roig-Villanova I，et al. Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLH family of transcription factors in Arabidopsis，poplar，rice，moss，and algae［J］. Plant Physiology，2010，153（3）：1398-1412.

［11］Atchley W R，Terhalle W，Dress A. Positional dependence，cliques，and predictive motifs in the bHLH protein domain［J］. Journal of Molecular Evolution，1999，48（5）：501-516.

［12］Massari M E，Murre C. Helix-loop-helix proteins：regulators of transcription in eucaryotic organisms［J］. Molecular and Cellular Biology，2000，20（2）：429-440.

［13］何 盈，雷云生，張 勁，等. 杜鵑bHLH轉(zhuǎn)錄因子RsMYC2的克隆及在非生物脅迫下的表達(dá)分析［J］. 分子植物育種，2023，21（4）：1103-1110.

［14］張 斌. 大豆轉(zhuǎn)錄因子基因GmbHLH130克隆及在干旱脅迫中的功能分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（7）：1441-1448.

［15］悅曼芳，張 春，鄭登俞，等. 玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmbHLH91對(duì)非生物逆境脅迫的應(yīng)答［J］. 作物學(xué)報(bào)，2022，48（12）：3004-3017.

［16］劉文文，李文學(xué). 植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展，2013，3（1）：7-11.

［17］Qiu J R，Huang Z，Xiang X Y，et al. MfbHLH38，a Myrothamnus flabellifolia bHLH transcription factor，confers tolerance to drought and salinity stresses in Arabidopsis［J］. BMC Plant Biology，2020，20（1）：542.

［18］Lu R，Zhang J，Liu D，et al. Characterization of bHLH/HLH genes that are involved in brassinosteroid （BR） signaling in fiber development of cotton （Gossypium hirsutum）［J］. BMC Plant Biology，2018，18（1）：304.

［19］Ariyarathne M A，Wone B W M. Overexpression of the Selaginella lepidophylla bHLH transcription factor enhances water-use efficiency，growth，and development in Arabidopsis［J］. Plant Science，2022，315：111129.

［20］Li Z X，Liu C，Zhang Y，et al. The bHLH family member ZmPTF1 regulates drought tolerance in maize by promoting root development and abscisic acid synthesis［J］. Journal of Experimental Botany，2019，70（19）：5471-5486.

［21］Seo J S，Joo J，Kim M J，et al. OsbHLH148，a basic helix-loop-helix protein，interacts with OsJAZ proteins in a jasmonate signaling pathway leading to drought tolerance in rice［J］. The Plant Journal，2011，65（6）：907-921.

［22］Xu W R，Zhang N B，Jiao Y T，et al. The grapevine basic helix-loop-helix （bHLH） transcription factor positively modulates CBF-pathway and confers tolerance to cold-stress in Arabidopsis［J］. Molecular Biology Reports，2014，41（8）：5329-5342.

［23］Cao X J，Wen Z，Shen T J，et al. Overexpression of PavbHLH28 from Prunus avium enhances tolerance to cold stress in transgenic Arabidopsis［J］. BMC Plant Biology，2023，23（1）：652.

［24］Meng F W，Yang C，Cao J D，et al. A bHLH transcription activator regulates defense signaling by nucleo-cytosolic trafficking in rice［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2020，62（10）：1552-1573.

［25］Chen C，Liu F，Zhang K X，et al. MeJA-responsive bHLH transcription factor LjbHLH7 regulates cyanogenic glucoside biosynthesis in Lotus japonicus［J］. Journal of Experimental Botany，2022，73（8）：2650-2665.

［26］理 雅，劉博婷，賴思慧，等. 鐵皮石斛DcbHLH14基因克隆及表達(dá)分析［J］. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，37（9）：1145-1155.

［27］張 斌. 大豆轉(zhuǎn)錄因子基因GmbHLH130克隆及在干旱脅迫中的功能分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（7）：1441-1448.

［28］Li C，Cai X，Shen Q Y，et al. Genome-wide analysis of basic helix-loop-helix genes in Dendrobium catenatum and functional characterization of DcMYC2 in jasmonate-mediated immunity to Sclerotium delphinii［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13：956210.

［29］沈金秋，鄭仲仲，潘偉槐，等. 植物CBL-CIPK信號(hào)系統(tǒng)的功能及其作用機(jī)理［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（5）：641-650.

［30］李 宇，李素貞，陳茹梅，等. 植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào)，2023，39（7）：26-36.

［31］Sun W J，Jin X，Ma Z T，et al. Basic helix-loop-helix （bHLH） gene family in Tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum）：genome-wide identification，phylogeny，evolutionary expansion and expression analyses［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2020，155：1478-1490.

［32］蔡 欣，黃鈺杏，崔明月，等. 水稻OsbHLH109基因的表達(dá)分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，50（12）：120-130.

［33］王菊萍，王 珍，張鐵軍，等. 蒺藜苜蓿MtbHLH148轉(zhuǎn)錄因子的克隆與轉(zhuǎn)化及其功能分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2019，39（6）：963-973.

［34］朱璐璐，周 波. bHLH蛋白在植物發(fā)育及非生物脅迫中的調(diào)控［J］. 分子植物育種，2022，20（20）：6750-6760.

［35］Castilhos G，Lazzarotto F，Spagnolo-Fonini L，et al. Possible roles of basic helix-loop-helix transcription factors in adaptation to drought［J］. Plant Science，2014，223：1-7.

［36］Zhai Y Q，Zhang L C，Xia C，et al. The wheat transcription factor，TabHLH39，improves tolerance to multiple abiotic stressors in transgenic plants［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，473（4）：1321-1327.

［37］Li C J，Yan C X，Sun Q X，et al. The bHLH transcription factor AhbHLH112 improves the drought tolerance of peanut［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：540.