摘要：為研究DREBA6b基因在芹菜非生物脅迫中的作用機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出芹菜DREBA6b基因參考序列并設(shè)計(jì)引物從津南實(shí)芹中克隆到該基因全長(zhǎng)cDNA，并命名為AgDREBA6b，對(duì)該基因結(jié)構(gòu)、序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行生物信息分析，并利用qPCR檢測(cè)該基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明：（1）理化性質(zhì)表明，AgDREBA6b含1個(gè)長(zhǎng)度為1 023 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼340個(gè)氨基酸，含有典型的AP2轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域；AgDREBA6b 蛋白是親水性蛋白，不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。（2）同源序列比對(duì)顯示，AgDREBA6b蛋白與其他植物DREB蛋白具有高度保守性，與天竺葵和胡蘿卜親緣關(guān)系最近。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)含13種順式元件，其中2種植物生長(zhǎng)發(fā)育元件、6種激素響應(yīng)元件和5種脅迫響應(yīng)元件。（3）qPCR分析顯示，AgDREBA6b基因在低溫、高溫、干旱、高鹽等逆境脅迫誘導(dǎo)下具有不同的表達(dá)模式，在低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)后先上調(diào)再下調(diào)，然而高溫下隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，說(shuō)明AgDREBA6b基因受非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，尤其高溫響應(yīng)更為顯著。

關(guān)鍵詞：芹菜；AgDREBA6b；克??；基因表達(dá)模式；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S188；S636.301" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0233-09

收稿日期：2024-05-07

基金項(xiàng)目：塔里木大學(xué)校長(zhǎng)基金（編號(hào)：TDZKSS202245）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：202310757011）；林下經(jīng)濟(jì)特種經(jīng)濟(jì)作物栽培技術(shù)示范基金（編號(hào)：1117989）。

作者簡(jiǎn)介：謝芳杰（1995—），女，河南商丘人，碩士，講師，主要研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：17778649365@163.com。

植物在自然環(huán)境狀態(tài)下遭受著各種非生物脅迫的威脅。非生物脅迫包括干旱、高溫、高鹽和低溫，對(duì)植物的適應(yīng)性、生物量和產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響［1-2］。植物可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）調(diào)節(jié)應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中眾多基因的表達(dá)來(lái)對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)［3］。通常響應(yīng)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子主要有AP2/ERF、WRKY（因其含色氨酸-精氨酸-賴(lài)氨酸-酪氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-賴(lài)氨酸保守序列得名）、bZIP、NAC和MYB等幾大類(lèi)［4］。其中，DREB（dehydration responsive element-binding protein）是轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF基因家族的一個(gè)分支，含有1個(gè)由60～70個(gè)氨基酸殘基組成的保守結(jié)構(gòu)域，位于第14位的V（纈氨酸）和第19位的E（谷氨酸）對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與順勢(shì)元件的結(jié)合，使下游功能基因在干旱、高鹽和高溫等逆境脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5］。

DREB基因家族在不同物種間的基因數(shù)量、基因結(jié)構(gòu)及功能存在顯著差異，根據(jù)序列相似性可分為A1～A6亞族［6］。其中A1成員主要參與冷脅迫反應(yīng)，A2成員主要參與干旱和高鹽應(yīng)激調(diào)節(jié)。A3～A6成員的功能與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫都有一定關(guān)系［7-9］。如大豆GmDREB2是A5組成員，它在擬南芥中的過(guò)表達(dá)使植物對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受性增強(qiáng)，而不會(huì)引起生長(zhǎng)遲緩［10］。擬南芥A6組成員RAP2.4可在干旱脅迫條件下激活葉片中表皮蠟的生物合成［11］。作為PrPDAT2的上游調(diào)節(jié)因子，樹(shù)牡丹中PrDREB2D導(dǎo)致PrPDAT2表達(dá)降低，從而參與調(diào)控種子ALA積累［12］。以往大多數(shù)研究集中在A1組和A2組。然而，近年來(lái)關(guān)于A6型DREB基因研究成為國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)［13］。目前已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［14］、蘋(píng)果（Malus pumil）［15］、大豆（Glycine max）［5，16］、小麥（Triticum aestivum）［17］、油菜（Brassica napus）［18］和菠蘿（Ananas comosus）［19］等多種植物中分別鑒定出56、60、73、48、194、20個(gè)家族基因。

芹菜（Apium graveolens L.）為傘形科一年或多年生草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸的沼澤地帶，在中國(guó)已有2 000多年的栽培史。芹菜營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的食用和藥用價(jià)值，日漸成為國(guó)內(nèi)外主要栽培的重要蔬菜之一［20-21］。津南實(shí)芹是天津津南區(qū)選育的優(yōu)良品種，葉片肥厚，商品性狀好，抗性強(qiáng)。本研究從津南實(shí)芹中克隆了1個(gè)AgDREBA6b基因，對(duì)其編碼氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析，并利用qPCR研究基因在非生物脅迫下（干旱、鹽、低溫和高溫）的特異性響應(yīng)，旨在進(jìn)一步為AgDREBA6b基因參與芹菜的抗逆性分子機(jī)制和基因功能的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為芹菜品種津南實(shí)芹，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)地點(diǎn)位于塔里木大學(xué)園藝與林學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，于2023年9月將種子播種并置于人工氣候室內(nèi)。參照文獻(xiàn)［22］設(shè)置培養(yǎng)條件，待芹菜植株長(zhǎng)至4月齡，進(jìn)行高溫（38 ℃）、低溫（4 ℃）、高鹽（200 mmol/L NaCl）、干旱（10%PEG-8000）脅迫，分別處理0、1、6、24 h，取成熟的葉片作為待測(cè)樣品，所有樣品均設(shè)置3次重復(fù)。放入液氮中速凍后，儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 芹菜總RNA提取及cDNA合成

使用植物組織總RNA提取試劑盒（擎科生物科技股份有限公司，北京）提取芹菜葉片中的總RNA，并用1%（體積分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)Nano Drop 2000（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）檢測(cè)RNA的質(zhì)量及濃度。將質(zhì)量檢測(cè)合格的總RNA使用GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Mix Rnasin selected試劑盒（擎科，北京）中按照推薦的反應(yīng)體系將其反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，并用紫外分光光度計(jì)Nano Drop 2000測(cè)定cDNA的濃度，然后保存在-20 ℃冰箱中備用，用于非生物脅迫基因表達(dá)模式分析（選用處理時(shí)間為0 h的cDNA為基因克隆試驗(yàn)的擴(kuò)增模板）。

1.3 AgDREBA6b基因克隆

以擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族為信息探針，結(jié)合芹菜轉(zhuǎn)錄組為基礎(chǔ)，檢索得到芹菜AgDREBA6b的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物F（5′-ATGATGACAGGTGGTATAG-3′）和R（5′-CTGACGTCATCCCTGATGTCATAA-3′）。以“津南實(shí)芹”cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸10 min，30個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與pUCm-T載體連接并轉(zhuǎn)化至DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，然后送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 AgDREBA6b生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)AgDREBA6b基因序列進(jìn)行翻譯并獲得其蛋白序列。運(yùn)用ExPASy（https：//web.expasy.org/）預(yù)測(cè)AgDREBA6b蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、原子總數(shù)、等電點(diǎn)以及親疏水性。使用SOPMA和在線(xiàn)網(wǎng)站phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/）分別分析該基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用WoLF PSORT預(yù)測(cè)該基因的亞細(xì)胞定位。利用TMHMM 2.0 Server在線(xiàn)網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和SignalP-4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。使用NCBI的BLAST搜索其他植物的DREB氨基酸序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，并使用MEGA 5.0軟件基于鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（自展值為1 000）。使用PlantCARE在線(xiàn)軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子序列上的順式作用元件。

1.5 熒光定量qRT-PCR分析

AgDREBA6b基因引物由Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)（F：5′-TCCAAGCCCAGATCCAACTCCA-3′；R：ACCAAAGTCGGGTTCGGTTCTT-3′）。以Actin作為內(nèi)參基因，引物為（F：5′-GAAATCACAGCACTTGCACC-3′；R：5′-AAGCCTTTGATCTTGAGAGC-3′），將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后作為qPCR反應(yīng)模板。qPCR按照2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）（全式金生物科技股份有限公司，北京）推薦的反應(yīng)體系，并使用Bio-Rad-CFX96TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，CA，USA）完成擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)3次技術(shù)重復(fù)。該基因的qPCR分析以芹菜Actin為內(nèi)參基因，通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量［23］，以相對(duì)表達(dá)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n= 3）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所用數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS 20，AgDREBA6b基因相對(duì)表達(dá)量采用單因素方差分析和多重比較Tukey檢驗(yàn)顯著性，顯著差異性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜AgDREBA6b基因克隆與序列分析

以芹菜葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 1 023 bp 的目的基因條帶，其長(zhǎng)度與預(yù)期基本一致（圖1）。將其命名為AgDREBA6b基因（GenBank登錄號(hào)：OR727346）。該基因包含1個(gè)1 023 bp的完整開(kāi)放閱讀框，預(yù)測(cè)編碼了340個(gè)氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)包含AP2結(jié)構(gòu)域（PF00847），其中60個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域可與DNA結(jié)合，存在于轉(zhuǎn)錄過(guò)程，屬于典型的DREB1/CBF轉(zhuǎn)錄因子。

2.2 AgDREBA6b蛋白理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)ExPASy在線(xiàn)軟件分析芹菜AgDREBA6b蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果（圖2）表明，芹菜AgDREBA6b蛋白分子式為C1 670H2 569N443O526S14，原子總數(shù)為 5 222，相對(duì)分子量為37.72 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為6.54，表明芹菜AgDREBA6b為酸性蛋白?？偲骄H水性值為-0.614，具有較強(qiáng)的親水性。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為53.35，脂溶性指數(shù)為57.71，推測(cè)為不穩(wěn)定性蛋白。該蛋白氨基酸序列共20種氨基酸組成，其中絲氨酸數(shù)量最多，為47個(gè)（占13.8%），半胱氨酸和色氨酸數(shù)量最少，均為4個(gè)，占比均為1.2%（表1）。共有33個(gè)帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）和32個(gè)帶正電荷的殘基（Arg+Lys）。

2.3 芹菜AgDREBA6b蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AgDREBA6b蛋白由26.47%的α-螺旋、61.76%的無(wú)規(guī)則卷曲、10%的延伸鏈、1.76%的β轉(zhuǎn)角組成（圖2-A）。根據(jù) AlphaFold DB model（gene ID：A0A165XQ40）構(gòu)建的模型與其序列的一致性達(dá)到" 87.92%， 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)

測(cè)和同源建模分析表明，與二級(jí)分析結(jié)果基本一致（圖2-B）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，AgDREBA6b基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核。利用TMHMM 2.0 Server在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)了芹菜AgDREBA6b蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果表明該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白。SignalP-4.1預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白中存在信號(hào)肽的概率僅為0.45%，這表明芹菜AgDREBA6b為非分泌蛋白。NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)存在58個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中38個(gè)是絲氨酸（Ser），17個(gè)是蘇氨酸（Thr），3個(gè)是酪氨酸（Tyr）（圖2-C）。

2.4 AgDREBA6b蛋白質(zhì)的同源比對(duì)和進(jìn)化分析

將AgDREBA6b基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明AgDREBA6b與其他植物DREB轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性（圖3）。它與天竺葵（Heracleum sosnowskyi，KAK1361703.1）和胡蘿卜（Daucus carota，AIX48026.1）編碼的同源蛋白質(zhì)相似性達(dá)到最高，分別為89.44%和85.00%，推測(cè)它們可能具有相同的生物學(xué)功能。然而，與伊德斯種咖啡（Coffea eugenioides，XP_027178525.1）和楊梅（Morella rubra，KAB1199840.1）的相似性較低，分別為52.05%和53.35%。利用MEGA 5.0軟件將該基因編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的27種植物中的DREB序列構(gòu)建neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，AgDREBA6b與天竺葵和胡蘿卜DREB蛋白聚為同一支，親緣關(guān)系較接近；與其他物種如木薯、橡膠樹(shù)、麻風(fēng)樹(shù)、毛白楊和銀白楊的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 啟動(dòng)子分析

順式調(diào)控序列是非編碼DNA的線(xiàn)性核苷酸區(qū)域，其定位會(huì)因基因活動(dòng)而改變。啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，通過(guò)分析順式作用元件組成，可了解基因的功能及其表達(dá)潛力。通過(guò)Plant CARE分析芹菜AgDREBA6b啟動(dòng)子區(qū)域 1 023 bp 序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域含有13種順式作用元件，包括2個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件、6個(gè)植物激素響應(yīng)元件、5個(gè)脅迫響應(yīng)元件（表2）。植物生長(zhǎng)發(fā)

育響應(yīng)元件包含1個(gè)GATA-motif和1個(gè)GT1-motif共2個(gè)光響應(yīng)元件。植物激素響應(yīng)元件在3種元件中占了最大的比例，其中含有1個(gè)ABRE脫落酸響應(yīng)元件，4個(gè)茉莉酸甲酯應(yīng)答元件（2個(gè)CGTCA-motif和2個(gè)TGACG-motif），1個(gè)P-box赤霉素應(yīng)答元件。脅迫響應(yīng)元件含有2個(gè)抗氧化應(yīng)答元件（ARE）、1個(gè)低溫應(yīng)答元件（LTR）和2個(gè)干旱誘導(dǎo)元件（MBS）。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果推測(cè)AgDREBA6b基因參與了芹菜對(duì)植物發(fā)育、激素及脅迫的響應(yīng)。

2.6 芹菜AgDREBA6b基因在非生物脅迫下的表達(dá)水平

本研究基于轉(zhuǎn)錄組并利用qPCR技術(shù)對(duì)該基因在不同脅迫各時(shí)期下（0、1、6、24 h）的表達(dá)模式驗(yàn)證分析。由圖5可知，高溫、低溫、高鹽和干旱脅迫均能誘導(dǎo)芹菜AgDREBA6b基因的表達(dá)。其中AgDREBA6b基因處于高溫脅迫時(shí)，表達(dá)量逐漸上升，在24 h脅迫處理時(shí)，表達(dá)量達(dá)到峰值，是0 h的15.89倍，高于同期其他脅迫下的表達(dá)量。低溫、高鹽及干旱脅迫下，AgDREBA6b基因表達(dá)量變化曲線(xiàn)相似，均表現(xiàn)為先上升，達(dá)到峰值后下降。低溫脅迫下，1 h處理時(shí)，表達(dá)量變化不明顯，到達(dá)6 h時(shí)，表達(dá)量出現(xiàn)峰值，約為0 h的24.39倍，高于任何時(shí)期及脅迫下的表達(dá)量，隨后表達(dá)量逐漸下降；AgDREBA6b基因?qū)Ω啕}脅迫的響應(yīng)相較遲鈍，1 h時(shí)，表達(dá)量有所上調(diào)，為0 h的2.47倍，在6 h時(shí)出現(xiàn)峰值，為0 h的6.45倍，24 h時(shí)表達(dá)量有所下降，與1 h時(shí)的表達(dá)量近乎相等；干旱脅迫下，1 h時(shí)，表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化，6 h處理時(shí)表達(dá)量到達(dá)峰值，約為0 h的13.12倍，隨后表達(dá)量逐漸下降。

3 討論

植物在不良環(huán)境會(huì)進(jìn)化出一系列自身內(nèi)在的

分子機(jī)制，以響應(yīng)環(huán)境脅迫。非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、質(zhì)量和產(chǎn)量主要因素之一［24］。DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠與DRE/CRT順式作用元件或具有DRE元件核心序列特異性結(jié)合，從而在植物遭遇極端溫度、干旱和高鹽等非生物脅迫反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［25］。本研究利用Li等已發(fā)布的芹菜基因組［26］，使用PCR擴(kuò)增技術(shù)在津南實(shí)芹中克隆得到了1個(gè)AgDREBA6b基因，該基因包含高度保守的AP2/ERF DNA結(jié)合域，這與其他關(guān)于DREB轉(zhuǎn)錄因子家族研究結(jié)果［27］一致。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋是芹菜DREB蛋白二級(jí)機(jī)構(gòu)的主要組成部分，這與譚萌萌等在細(xì)葉百合中研究［28］一致。經(jīng)同源序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，顯示該蛋白與天竺葵和胡蘿卜同源性相似性較高，且親緣關(guān)系較接近，暗示可能具有相似或者相近的生物學(xué)功能。對(duì)啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，AgDREBA6b含有13種順式作用元件，其中植物激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件比例較高，推測(cè)該基因在脅迫中起著重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。

近年來(lái)，隨著不同物種中DREB家族基因陸續(xù)被克隆和功能分析，在植物脅迫響應(yīng)中的作用正逐漸被揭示。如過(guò)表達(dá)VuDREB2A-CA提高了豇豆在干旱和熱脅迫下的抗氧化能力、滲透調(diào)節(jié)能力和光合產(chǎn)量［29］。CiDREB6主要在高溫和干旱條件下被誘導(dǎo)，而在低溫和高鹽條件下則沒(méi)有被誘導(dǎo)［30］。在麻風(fēng)樹(shù)中，冷、鹽和干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)JcDREB的表達(dá)，但ABA（脫落酸）無(wú)法誘導(dǎo)該基因表達(dá)［31］。藥用植物香鱗毛蕨在干旱、NaCl和高溫處理時(shí)，DfDREB基因表達(dá)均上調(diào)，但在低溫脅迫 1～6 h和24 h時(shí)無(wú)明顯變化［32］。茶樹(shù)CsDREB-A2能快速響應(yīng)高溫和干旱脅迫，但對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)較為緩慢［33］。以上研究表明DREB基因可以提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性，但其響應(yīng)的表達(dá)模式有所不同［34］。DREB通常能夠通過(guò)基因表達(dá)量上調(diào)來(lái)應(yīng)對(duì)各種脅迫［24］。如苦蕎在經(jīng)歷干旱脅迫 6～12 h后，F(xiàn)tDREB1和FtDREB2基因表達(dá)量幾小時(shí)內(nèi)達(dá)到最高，之后開(kāi)始下降，但均高于脅迫前［35］，二穗短柄草中DREB1G基因亦是如此［36］。在日本結(jié)縷草葉片中，ZjDREB1.4在低溫、高鹽和干旱脅迫下基因表達(dá)量均表現(xiàn)出上調(diào)，其中低溫脅迫中上調(diào)最為顯著［37］。李彤等的研究表明，CsDREB-A4b基因的相對(duì)表達(dá)量在高溫（38 ℃）脅迫處理后顯著高于脅迫處理前［38］。本研究中AgDREBA6b受到低溫、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)后基因表達(dá)先上調(diào)再下調(diào)，其中在6 h達(dá)到峰值，24 h表達(dá)下調(diào)。高溫脅迫下，AgDREBA6基因表達(dá)量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，但該脅迫處理并未出現(xiàn)拐點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。值得注意的是，脅迫1 h時(shí)，AgDREBA6b在4種脅迫下基因表達(dá)量變化并不明顯，當(dāng)處理時(shí)間增加至6 h，該基因被顯著誘導(dǎo)，可能由于芹菜植株在初期剛感應(yīng)到脅迫信號(hào)，AgDREBA6b需進(jìn)行與啟動(dòng)子結(jié)合后才能被誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)脅迫在植株體內(nèi)積累到一定時(shí)期，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄量的誘導(dǎo)才得以體現(xiàn)。綜上所述，AgDREBA6b在干旱、鹽、低溫和高溫脅迫下基因表達(dá)量均高于0 h，這與前人研究一致，說(shuō)明該基因積極參與芹菜非生物脅迫響應(yīng)的分子信號(hào)途徑。然而，基因之間存在相互促進(jìn)和制約關(guān)系，僅憑表達(dá)分析模式來(lái)確定單個(gè)基因的功能并不完全合理。因此，今后可通過(guò)在芹菜中過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)驗(yàn)證其功能性。

4 結(jié)論

本研究從津南實(shí)芹中克隆獲得1個(gè)AgDREBA6b基因，并對(duì)AgDREBA6b基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和基因的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)AgDREBA6b在響應(yīng)多種非生物脅迫時(shí)，基因表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)現(xiàn)象，從而推測(cè)AgDREBA6b是調(diào)控芹菜抗逆的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究結(jié)果為AgDREBA6b基因的后續(xù)功能驗(yàn)證提供了參考，同時(shí)可為預(yù)測(cè)其他物種的功能性DREB基因提供一定的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］張 雨，蘇 旭，劉玉萍，等. 沙鞭PvDREB基因克隆與表達(dá)特異性分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2023，43（2）：202-210.

［2］Muthuramalingam P，Muthamil S，Shilpha J，et al. Molecular insights into abiotic stresses in mango［J］. Plants，2023，12（10）：1939.

［3］Zhu J K. Abiotic stress signaling and responses in plants［J］. Cell，2016，167（2）：313-324.

［4］Li T，Huang Y，Khadr A，et al. DcDREB1A，a DREB-binding transcription factor from Daucus carota，enhances drought tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana and modulates lignin levels by regulating lignin-biosynthesis-related genes［J］. Environmental and Experimental Botany，2020，169：103896.

［5］Zhou Y X，Zhou W，Liu H，et al. Genome-wide analysis of the soybean DREB gene family：identification，genomic organization and expression profiles in response to drought stress［J］. Plant Breeding，2020，139（6）：1158-1167.

［6］Su J C，Song S L，Wang Y T，et al. Genome-wide identification and expression analysis of DREB family genes in cotton［J］. BMC Plant Biology，2023，23（1）：169.

［7］Hussain Q，Asim M，Zhang R，et al. Transcription factors interact with ABA through gene expression and signaling pathways to mitigate drought and salinity stress［J］. Biomolecules，2021，11（8）：1159.

［8］Hu X Q，Xu X M，Li C H. Ectopic expression of the LoERF017 transcription factor from Larix olgensis Henry enhances salt and osmotic-stress tolerance in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Biotechnology Reports，2018，12（2）：93-104.

［9］Huang L Y，Wang Y X，Wang W S，et al. Characterization of transcription factor gene OsDRAP1 conferring drought tolerance in rice［J］. Frontiers in Plant Science，2018，9：94.

［10］陳金煥，夏新莉，尹偉倫. 植物DREB轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種，2007，5（增刊1）：29-35.

［11］Yang S U，Kim H，Kim R J，et al. AP2/DREB transcription factor RAP2.4 activates cuticular wax biosynthesis in Arabidopsis leaves under drought［J］. Frontiers in Plant Science，2020，11：895.

［12］Yang W Z，Xin Z W，Zhang Q Y，et al. The tree peony DREB transcription factor PrDREB2D regulates seed α-linolenic acid accumulation［J］. Plant Physiology，2024，195（1）：745-761.

［13］Mizoi J，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses［J］. Biochimica et Biophysica Acta，2012，1819（2）：86-96.

［14］Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，290（3）：998-1009.

［15］沈兵琪，高曉宇，王大瑋，等. 蘋(píng)果DREB轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組鑒定與分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2017，37（3）：460-469.

［16］孟凡立，李明月，洪志鵬，等. 轉(zhuǎn)TaDREB3a大豆品系KD1遺傳穩(wěn)定性分析及抗旱性鑒定［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，52（8）：1-11.

［17］張 蕾，魏愛(ài)麗，張曉軍，等. 小麥苗期鹽脅迫下DREB基因的表達(dá)［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2022，42（9）：1477-1486.

［18］Ghorbani R，Zakipour Z，Alemzadeh A，et al. Genome-wide analysis of AP2/ERF transcription factors family in Brassica napus［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants，2020，26（7）：1463-1476.

［19］Chai M N，Cheng H，Yan M K，et al. Identification and expression analysis of the DREB transcription factor family in pineapple ［Ananas comosus （L.） Merr.］［J］. PeerJ，2020，8：e9006.

［20］Raid R N. Celery diseases and their management［M］//Diseases of fruits and vegetables. Dordrecht：Kluwer Academic Publishers，2006：441-453.

［21］朱 鑫，沈火林. 芹菜幼苗耐熱性鑒定的主成分分析［J］. 中國(guó)蔬菜，2014（6）：28-33.

［22］楊青青，劉潔霞，徐志勝，等. 芹菜品種“津南實(shí)芹”AgICE1基因的克隆及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)［J］. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2019，28（1）：16-24.

［23］Vandesompele J，de Preter K，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］. Genome Biology，2002，3（7）：RESEARCH0034.

［24］Zhang Y，Xia P G. The DREB transcription factor，a biomacromolecule，responds to abiotic stress by regulating the expression of stress-related genes［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2023，243：125231.

［25］鄭佳秋，王薇薇，梅 燚，等. 辣椒DREB轉(zhuǎn)錄因子鑒定及其在澇害脅迫下的表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2023，39（1）：148-159.

［26］Li M Y，F(xiàn)eng K，Hou X L，et al. The genome sequence of celery （Apium graveolens L.），an important leaf vegetable crop rich in apigenin in the Apiaceae family［J］. Horticulture Research，2020，7：9.

［27］Aydn Akbudak M，F(xiàn)iliz E，Kontbay K. DREB2（dehydration-responsive element-binding protein 2） type transcription factor in sorghum （Sorghum bicolor）：genome-wide identification，characterization and expression profiles under cadmium and salt stresses［J］. 3 Biotech，2018，8（10）：426.

［28］譚萌萌，孫紹營(yíng)，王靜文，等. 細(xì)葉百合DREB轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)及脅迫應(yīng)答表達(dá)分析［J］. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2023，38（1）：95-101，198.

［29］Kumar S，Muthuvel J，Sadhukhan A，et al. Enhanced osmotic adjustment，antioxidant defense，and photosynthesis efficiency under drought and heat stress of transgenic cowpea overexpressing an engineered DREB transcription factor［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2022，193：1-13.

［30］Niu X，Luo T L，Zhao H Y，et al. Identification of wheat DREB genes and functional characterization of TaDREB3 in response to abiotic stresses［J］. Gene，2020，740：144514.

［31］Tang M J，Liu X F，Deng H P，et al. Over-expression of JcDREB，a putative AP2/EREBP domain-containing transcription factor gene in woody biodiesel plant Jatropha curcas，enhances salt and freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana［J］. Plant Science，2011，181（6）：623-631.

［32］湯 珣，官亞琳，陳玲玲，等. 香鱗毛蕨DfDREB基因克隆與表達(dá)模式分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2020，40（7）：1105-1113.

［33］韓妙華，滕瑞敏，李 輝，等. 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與非生物脅迫響應(yīng)分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（12）：2647-2657.

［34］賈 鑫，曾 臻，陳 月，等. 月季“月月粉”RcDREB2A的克隆與表達(dá)分析［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2022，49（9）：1945-1956.

［35］劉為遠(yuǎn)，劉桂男，陳 雙，等. 苦蕎轉(zhuǎn)錄因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（5）：1985-1992.

［36］Elhassan E E，牛 欣，蘇亞麗，等. 二穗短柄草DREB1G基因表達(dá)模式分析和在擬南芥中的異源過(guò)量表達(dá)［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，28（1）：89-96.

［37］馮婉倩，李 京，鄒慧敏，等. 日本結(jié)縷草轉(zhuǎn)錄因子基因ZjDREB1.4的功能特征分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2019，39（5）：848-856.

［38］李 彤，嚴(yán)雅君，韓洪潤(rùn)，等. 茶樹(shù)品種“安吉白茶”CsDREB-A4b基因的克隆及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)［J］. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2016，25（2）：1-9.