摘要：茶［Camellia sinensis（L.） Kuntze］因其極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)重要性而在全球范圍內(nèi)種植。為了研究茶樹中BURP的作用，基于茶樹全基因組對茶樹中BURP基因家族進(jìn)行篩選和鑒定。通過TBtools查找篩選包含有PF03181結(jié)構(gòu)域的序列，使用生物信息學(xué)對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和共線性關(guān)系等分析。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挑選對脅迫響應(yīng)較強(qiáng)烈的基因4個，即CsBURP14、CsBURP7、CsBURP10和CsBURP15，利用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）方法檢測其在冷、鹽和干旱脅迫下的表達(dá)情況。利用茶樹基因組數(shù)據(jù)鑒定出17個BURP基因，聚類為3個亞組，其中PG1β-like包含5條，BNM2-like包含8條，RD22-like包含4條。結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)只有11條基因包含完整的BURP結(jié)構(gòu)域，6條序列只包含其中的1或2個motif，而CsBURP1不包含這3個motif。CsBURP14、CsBURP7、CsBURP10和CsBURP15均響應(yīng)干旱脅迫、冷脅迫和鹽脅迫。CsBURP7響應(yīng)最劇烈，在低溫處理下為負(fù)調(diào)控，保持在初始表達(dá)量的1/3左右，干旱處理則為正調(diào)控，12 h時為初始值的6倍。CsBURP家族對低溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫均有響應(yīng)，推測其在茶樹抗逆中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：BURP基因家族；茶樹；基因表達(dá)；非生物脅迫；全基因組鑒定

中圖分類號：S188；S571.101" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0242-11

收稿日期：2024-10-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金（編號：U23A20213）；安徽省茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號：AHCYJSTX-11）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（編號：2024YL041）。

作者簡介：孫明慧（1994—），女，河南睢縣人，碩士，助理研究員，主要從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：sunminghui@aaas.org.cn。

通信作者：王文杰，研究員，主要從事茶樹新品種選育、茶葉加工與品質(zhì)研究。E-mail：391590137@qq.com。

BURP是植物界特有的一類在響應(yīng)植物脅迫、參與種子和花藥發(fā)育、物質(zhì)代謝中起到重要作用的蛋白質(zhì)。BURP可大致分為4個亞科，包括油菜的一種小孢子蛋白BNM2（Brassica napus microspore protein 2）［1］，蠶豆的一種未知種子蛋白USP（unknown seed protein from faba bean）［2］，擬南芥中的脫水反應(yīng)蛋白RD22（responsive to dehy-dration 22 protein）［3］，番茄多聚半乳糖醛酸酶同工酶1個非催化β-亞基PG1β（β-subunit of polygalacturonase isozyme 1 from tomato fruit）［4］，BURP的命名即來源于這4個亞科的首字母。BURP家族基因可以根據(jù)相似性被分為BNM2-like，USP-like，RD22-like和PG1β-like 4個亞組。除此之外，還有在水稻中新發(fā)現(xiàn)的BURPV、BURPVⅠ和BURPVⅡ家族［5］，后續(xù)又在玉米和高粱中發(fā)現(xiàn)BURPⅧ亞家族［6］。BURP基因家族的蛋白均包含1個保守的BURP結(jié)構(gòu)域，即4個連續(xù)的CH殘基，可用CH—X10—CH—X25－27—CH—X25－26—CH通式表示，其中X可以代表任何氨基酸。這些亞組分別具有各自的結(jié)構(gòu)特征，比如RD22-like蛋白和PG1β-like含有一個額外的富含G殘基串聯(lián)重復(fù)序列［7］。有研究推測BURP蛋白可能作為一種分泌蛋白分泌到細(xì)胞外或被運(yùn)送到特定的部位［8］。

BURP家族蛋白在脅迫反應(yīng)、植物營養(yǎng)和生殖發(fā)育中發(fā)揮著不同的作用。前人的研究表明，脫落酸（abscisic acid，ABA）和水楊酸（salicylic acid，SA）信號通路對脅迫反應(yīng)和植物防御非常重要［9］。棉花（Gossypium hirsutum）［10］熒光定量PCR結(jié)果分析顯示，26個GhBURP受到ABA和SA的誘導(dǎo)，表明該基因家族可能參與ABA或SA信號通路。在棗樹（Ziziphus jujuba）［11］中，所有ZjBURP均響應(yīng)低溫、鹽和干旱的脅迫，ZjPG1基因可能在低溫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而ZjBNM7、ZjBNM8和ZjBNM9較響應(yīng)干旱脅迫。月季花（Rosa chinenesis）中RcBURP4增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱脅迫的耐受性，過表達(dá)RcBURP4的擬南芥提高了幼苗期擬南芥在ABA、NaCl、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理下的耐受性［12］。水稻（Oryza sativa）中除了OsBURP01和OsBURP13這2個基因之外，所有其他成員都受到干旱、鹽、寒冷和脫落酸中至少1種脅迫的誘導(dǎo)。OsBURP05和OsBURP16對所有脅迫處理都有反應(yīng)。水稻OsBURP16編碼一種前體果膠降解酶，其過表達(dá)導(dǎo)致水稻對冷的抗性降低，細(xì)胞間黏附性降低［13］。OsBURP16的轉(zhuǎn)錄受冷、鹽和干旱脅迫以及脫落酸處理的誘導(dǎo)［14］。與對照相比，OsBURP16的過表達(dá)增強(qiáng)了對寒冷、鹽度和干旱脅迫的敏感性。

除了在脅迫響應(yīng)中的作用，BURP家族蛋白在生長發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。Pg1β（β-subunit of polygalacturonase isozyme1）是番茄Pg1復(fù)合體的一個亞基，在番茄果實(shí)成熟時將果膠多糖溶解在細(xì)胞壁中［4］。擬南芥中有3個Pg1β-like基因即Arabidopsis PG1β-like proteins（AtPGL）1-3，其中AtPGL3高表達(dá)品系的蓮座葉大小高于野生型，有利于擬南芥的生長發(fā)育［15］。棉花中的AtRD22-Like基因GhRDL1主要在伸長的纖維細(xì)胞中表達(dá)，而且GhRDL1和α擴(kuò)張蛋白（α-expansin protein，EXPA）GhEXPA1基因可以相互作用，在擬南芥中的共表達(dá)使?fàn)I養(yǎng)生長速度明顯加快，促進(jìn)植物生長和果實(shí)生產(chǎn)，有利于棉花產(chǎn)生更高的生物量［16］。

目前，關(guān)于BURP的研究已在月季花［12］、玉米和高粱［6］、水稻［5］、青花菜［17］、棗樹［18］、菜豆［19］、蘋果［20］、毛楊果［21］、陸地棉［22］、苜蓿［23］、鷹嘴豆［24］、大豆［25］、二穗短柄草［26］等單子葉或雙子葉植物中開展。茶樹因其極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)重要性而在全球范圍內(nèi)種植。然而，茶樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到各種非生物脅迫的阻礙。在本研究中，筆者所在課題組在基因組水平上對茶樹BURP基因進(jìn)行了鑒定和分析。在茶樹基因組中鑒定出17個BURP基因，這些基因在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體和亞細(xì)胞定位以及啟動子中的順式調(diào)控元件等方面都有廣泛的特征。此外，本研究還對茶樹在不同非生物脅迫條件下進(jìn)行了整體表達(dá)分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究于2024年5—7月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行。茶樹舒茶早（C. sinensis SCZ）全基因組數(shù)據(jù)和油茶（Camellia oleifera）全基因組數(shù)據(jù)來源于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的數(shù)據(jù)庫TPIA（http：//tpia.teaplants.cn/index.html）。水稻BURP基因家族的數(shù)據(jù)來源于水稻數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu）［5］，擬南芥BURP基因家族信息來源于擬南芥信息資源網(wǎng)站（TAIR：https：//www.arabidopsis.org/）。

1.2 茶樹BURP基因的篩選鑒定、基因結(jié)構(gòu)、保守基序與染色體定位

下載BURP保守結(jié)構(gòu)域PF03181的HMM文件Pfam（http：//pfam.xfam.org/），使用TBtools在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白序列檢索，將Elt;10-5的基因ID號匯總。利用NCBI的Conversed Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）工具將所得序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，確定茶樹BURP基因家族成員。使用TBtools將每個基因在染色體上的物理位置繪制成圖，按照基因在染色體上的先后順序命名為CsBURP1～CsBURP17。使用在線分析工具M(jìn)EME（http：//cryptoslate.com/coins.meme/）對CsBURP的蛋白保守基序進(jìn)行分析，基序的最大數(shù)值設(shè)為15；使用Gene Structure Display Server通過比較CsBURP基因的全長cDNA或預(yù)測編碼序列（CDS）與其相應(yīng)的基因組序列，繪制成基因結(jié)構(gòu)圖。

1.3 茶樹CsBURP蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用在線軟件Expasy（https：//www.expasy.org/resources/protparam）進(jìn)行基因家族等電點(diǎn)、氨基酸個數(shù)、分子量、脂肪族氨基酸指數(shù)和疏水性指數(shù)的預(yù)測。通過軟件TMHMM 2.0 （http：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）對家族的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。使用在線工具SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）進(jìn)行CsBURP家族的蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，亞細(xì)胞定位預(yù)測使用在線軟件Softberry（http：//www.softberry.com/）進(jìn)行。

1.4 CsBURP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和順式作用元件分析

將獲得的茶樹17條、擬南芥5條和水稻17條BURP序列，使用MEGA 7軟件，通過鄰接法（neighbor-joining）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。使用TBtools軟件提取CsBURP家族中各基因ATG起始位點(diǎn)上游2 000 bp的堿基序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE （https：//bioinformatics.psb.ugent.be/）對順式作用元件進(jìn)行預(yù)測和分析。對順式作用元件進(jìn)行計數(shù)，使用TBtools軟件進(jìn)行可視化，用于CsBURP家族基因的調(diào)控機(jī)制分析。

1.5 CsBURP家族種內(nèi)和種間共線性分析

為研究茶樹舒茶早與油茶2個物種CsBURP基因的進(jìn)化關(guān)系，利用TBTools中的One Step MC ScanX-Super Fast 進(jìn)行兩兩比較并用Dual Systeny Plot進(jìn)行可視化；利用TBtools內(nèi)置的Advanced Circos程序?qū)κ娌柙缥锓N內(nèi)的CsBURP共線性結(jié)果進(jìn)行可視化展示；使用Ks峰值估計分化時間，公式為T=Ks/2r，其中r=6.5×10-9［27］。

1.6 CsBURP受脅迫響應(yīng)的表達(dá)模式分析

從公共數(shù)據(jù)庫下載CsBURP的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括8個組織表達(dá)特異性數(shù)據(jù)［28］、低溫脅迫數(shù)據(jù)［29］、干旱處理數(shù)據(jù)和鹽脅迫數(shù)據(jù)［30］，使用TBtools制作轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)熱圖。

選取品比園中舒茶早新鮮枝條為材料進(jìn)行水培，于人工氣候室（24±2） ℃穩(wěn)定生長后進(jìn)行脅迫處理。低溫脅迫：（4±1） ℃低溫脅迫處理，分別于0、4、8、12、24、48 h摘取3～5個枝條的第2葉，作為低溫脅迫的樣品。干旱和高鹽處理：將舒茶早枝條轉(zhuǎn)移至PEG-6000溶液（濃度20%）和 200 mmol/L NaCl溶液分別模擬干旱脅迫和高鹽脅迫，采樣時間同低溫脅迫一致，作為干旱和高鹽脅迫樣品。使用NCBI Primer-BLAST在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計BURP的熒光定量引物（表1），以茶樹的β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20 μL，每個樣品進(jìn)行3次技術(shù)性重復(fù)以減少誤差。使用GraphPad prism7軟件作圖，采用IBM SPSS Statistics 21單因素方差分析對CsBURP表達(dá)水平的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹BURP家族基因的篩選鑒定與染色體定位

通過HMM文件比對，在茶樹基因組中初步獲得CsBURP基因家族成員蛋白序列，剔除不含有BURP家族特征結(jié)構(gòu)域PF03181的序列并人工去除冗余，最終獲得茶樹BURP基因家族成員17條。按照這些基因在染色體上的位置，依次命名為CsBURP1～CsBURP17。由圖1可知，基因分布在7條染色體和1個contig210上。除了染色體3上有7條，染色體10上有3條，染色體12上有2條以外，多數(shù)染色體上只有1條該家族的基因。染色體3上的8條基因和染色體10上的3條基因位置均較近。

2.2 CsBURP基因家族基因特征的可視化

為了進(jìn)一步了解基因家族的結(jié)構(gòu)，使用MEGA 7.0對茶樹CsBURP基因家族進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖2-A所示，17個成員可分為3個組。使用NCBI的CCD功能進(jìn)行BURP結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，并進(jìn)行可視化，如圖2-C所示，該家族的17個成員均包含有CsBURP的特征結(jié)構(gòu)域。使用MEME進(jìn)行保守基序的預(yù)測，共識別15個基序，結(jié)果如圖2-B所示，各組之內(nèi)的基序數(shù)量大致一致，保守基序個數(shù)為5～13個不等，其中包含7個保守基序的有5條序列，8和13個基序的各有3條序列，6和9個基序的各有2條序列，5和12個基序的各有1條序列。使用Interpro Scan在InterPro數(shù)據(jù)庫中對這15個保守繼續(xù)進(jìn)行檢索，結(jié)果如表2所示，其中motif 3、motif 4、motif 5為BURP-PS51277的結(jié)構(gòu)域，motif 8、motif 9、motif 11、motif 12為PG-associated-BURP，即PG1β-like 的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域。motif2、motif 6為BURP蛋白標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域，即4個連續(xù)的CH殘基，可用CH—X10—CH-X25－27—CH—X25－26—CH通式表示。由圖2可以看出，只有11條基因包含完整的BURP結(jié)構(gòu)域，6條序列只包含其中的1或2個motif，而CsBURP1不包含這3個motif，但是CsBURP1包含PG1β-like的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域PG-associated-BURP。使用Gene Structure Display Server對基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制，由圖2-D可見，CsBURP均包含 2～4個外顯子、1～4個內(nèi)含子，差異較小。

2.3 CsBURP的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線工具SOPMA進(jìn)行CsBURP家族的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，由表3可知，CsBURP的不規(guī)則卷曲的占比范圍是為32.13%～47.69%，α-螺旋為21.24%～36.09%，跨膜螺旋為17.14%～31.75%，β-轉(zhuǎn)角為6.35%～13.36%，CsBURP家族之間差異較小。使用在線軟件Expasy對CsBURP家族的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，CsBURP的氨基酸長度為258～635，長度差異較大。等電點(diǎn)為5.38～9.29，其中9個等電點(diǎn)小于7，為酸性蛋白，剩余的8個為堿性蛋白。分子量為28 790.07～69 295.64 u，差異較大； 親水性的平均值為-0.541～-0.014。

亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，該家族均定位在膜外。

2.4 CsBURP系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

為了分析茶樹CsBURP、AtBURP與OsBURP的進(jìn)化關(guān)系，將茶樹17條、擬南芥5條和水稻17條BURP使用MEGA 7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，采用鄰接法（neighbor-joining），Bootstrap檢驗(yàn)值設(shè)置為 1 000 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。如圖3所示，根據(jù)擬南芥和水稻的進(jìn)化關(guān)系分組，共分為PG1β-like、BNM2-like、RD22-like、BURPⅤ、BURPⅥ和BURPⅦ 6個組，茶樹的17個CsBURP基因僅占其中的3個組。其中PG1β-like包含5條，分別為CsBURP11、CsBURP12、CsBURP13、CsBURP9和CsBURP1，BNM2-like包含8條，分別為CsBURP8、CsBURP5、CsBURP17、CsBURP3、CsBURP4、CsBURP2、CsBURP7和CsBURP6，RD22-like包含4條，分別為CsBURP10、CsBURP16、CsBURP15和CsBURP14。

BURPⅤ、BURPⅥ和BURPⅦ組沒有CsBURP成員。

2.5 CsBURP啟動子順式作用元件預(yù)測

使用Tbtools對CsBURP家族中各基因的啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測和分析，并對15種啟動子元件的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，將結(jié)果進(jìn)行可視化。由圖4可以看出，CsBURP家族均包含較多的光響應(yīng)元件和逆境響應(yīng)元件。這些順式作用元件根據(jù)其功能分為4類：光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件（ABA、SA）、逆境響應(yīng)元件和植物生長發(fā)育元件。這些順式作用元件包括很多與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、厭氧誘導(dǎo)（ARE）、低溫響應(yīng)元件（LTR），據(jù)統(tǒng)計，除了CsBURP16，其余16個CsBURP基因至少含有這3種元件中的一種。除此之外，啟動子中還包含脅迫響應(yīng)元件（TGACG-motif）、光響應(yīng)元件（TCT-motif、BOX4等）。

2.6 茶樹CsBURP種內(nèi)及種間共線性分析

利用TBtools對舒茶早種間以及舒茶早與油茶的共線性進(jìn)行了分析。由圖5-A可以看出，舒茶早種內(nèi)CsBURP9和CsBURP11、CsBURP16和CsBURP14存在共線性關(guān)系，根據(jù)推測，2對基因可能分別在74.07百萬、68.71百萬年前發(fā)生了1次復(fù)制。從舒茶早與油茶的共線性分析可以看出，共有5個油茶和8個舒茶早產(chǎn)生8個共線性基因?qū)Γ?/p>

這8對共線性基因?qū)Φ姆峭x取代/同義取代比（Ka/Ks）均小于1（表4），舒茶早與油茶的分化時間大致為1.85百萬～127.93百萬年，差異較大。

2.7 CsBURP的差異性表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究CsBURP的表達(dá)情況，從公共數(shù)據(jù)庫下載組織表達(dá)情況和鹽脅迫、冷脅迫、干旱脅迫3種脅迫下的表達(dá)情況數(shù)據(jù)，使用TBtools制作熱圖。如圖6所示，除了CsBURP15、CsBURP14在8個組織中的表達(dá)量均較高，CsBURP13在芽、嫩葉和莖中表達(dá)量稍高，CsBURP17、CsBURP16、CsBURP2僅在根中表達(dá)量稍高，CsBURP家族的其他成員的組織表達(dá)量較低。CsBURP15、CsBURP14受3種脅迫（干旱脅迫、鹽脅迫和冷脅迫）的調(diào)控，其中干旱脅迫和鹽脅迫為負(fù)調(diào)控，表達(dá)量為下降趨勢，冷脅迫下則呈現(xiàn)為先下降后上升的趨勢。CsBURP7在干旱和鹽脅迫下均呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，CsBURP10則為先上升再下降的趨勢。CsBURP家族的其他成員的表達(dá)量較低。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)可知，CsBURP15、CsBURP14、CsBURP7和CsBURP10這4個基因較響應(yīng)脅迫，且組織表達(dá)特異性較高，因此設(shè)計這4個基因的熒光定量引物并進(jìn)行QPCR驗(yàn)證，引物設(shè)計見表1。采集冷脅迫、干旱脅迫和PEG脅迫后的茶樹葉片樣品進(jìn)行表達(dá)量模式的分析，以不同處理下 0 h 舒茶早葉片的表達(dá)量作為對照（即表達(dá)量視為1）。如圖7-A所示，在冷處理下，CsBURP15在4 h時呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05），表達(dá)量為 0 h 的2.5倍左右，在8 h表達(dá)水平顯著低于0 h，然后持續(xù)下降且表達(dá)量均顯著低于0 h（P＜0.05）。其余3個基因均受冷脅迫的負(fù)調(diào)控，且表達(dá)量均在4 h即顯著降低為0 h的1/3左右（P＜0.05），CsBURP14、CsBURP7的趨勢相似，在8 h顯著上升后再下降（P＜0.05），并在48 h再上升，但是始終顯著低于0 h的表達(dá)量（P＜0.05）。CsBURP10則持續(xù)降低，直至48 h有升高（P＜0.05）。

在PEG處理下（圖7-B），CsBURP7的表達(dá)模式是先上升，在12 h達(dá)到表達(dá)量的最高，為0 h表達(dá)量的6倍左右，隨后顯著下降，在48 h達(dá)到最低點(diǎn)；CsBURP10與CsBURP15的趨勢相似，為先下降再上升，不同的是CsBURP10在12 h時未超過0 h時的表達(dá)量，而CsBURP15超過0 h時的表達(dá)量，但沒有顯著性差異（P＞0.05），隨即表達(dá)量下降；CsBURP14的趨勢為在8 h顯著升高，隨即在12 h達(dá)到最高點(diǎn)，約為 0 h 表達(dá)量的2.5倍，隨后下降。這4個基因的共同點(diǎn)是，均在48 h達(dá)到表達(dá)量的最低點(diǎn)，且遠(yuǎn)低于 0 h 的表達(dá)量，為0 h表達(dá)量的1/13左右。

在鹽脅迫下（圖7-C），CsBURP7和CsBURP14的趨勢相似，呈鋸齒狀波動，交替上升下降。CsBURP7和CsBURP14在4 h先下降到0 h的1/2左右，隨即在8 h上升，在12 h下降然后再上升。CsBURP15和CsBURP10的趨勢相似，呈現(xiàn)下降的趨勢，在4 h先下降到0 h的1/2，在8 h下降到0 h的1/6，隨后CsBURP10在12 h稍有回升，CsBURP15則顯著性升高（P＜0.05）。在24 h又開始下降。相同的是，4個基因在脅迫后的表達(dá)量均低于0 h。

3 討論與結(jié)論

本研究通過全基因組篩選共鑒定出17個茶樹CsBURP家族成員，這與水稻［5］中的17個、毛果楊［21］中的18個、棗樹［18］中的17個、玉米［6］中15個、高粱［6］中11個相差不大；苜蓿［23］中則有39個BURP成員，個數(shù)較多，說明不同物種中BURP的功能與數(shù)量具有多樣性。BURP的命名由4個基因的

首字母組成，BURP家族成員最初包含4個亞家族，后續(xù)的研究又發(fā)現(xiàn)BURPⅤ、BURPⅥ和BURPⅦ［5］，BURPⅧ［6］共發(fā)現(xiàn)8個亞家族。根據(jù)之前的研究可知，這8個組中，PG1β-like和BURPV亞家族中既有雙子葉植物也有單子葉植物，BURPⅥ、BURPⅦ和BURPⅧ亞家族的大多數(shù)成員來自水稻、玉米等單子葉植物［6］，目前僅發(fā)現(xiàn)蘋果中的MdBURP1為BURPVI的成員［20］。USP-like、BNM2-like、RD22-like則為雙子葉植物特有的，均來自雙子葉植物。茶樹中共有3個組，即PG1β-like、BNM2-like、RD22-like，推測這是由于茶樹為雙子葉植物。17條基因分布在7條染色體和1個contig210上，其中染色體3上有7條，占總基因個數(shù)的41.2%。

使用MEME對基因家族的15個motif進(jìn)行預(yù)測后可視化，并用InterProScan 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，并不是所有的茶樹BURP基因都包含BURP的特征區(qū)域。motif 2、motif 4、motif 6為BURP蛋白標(biāo)志性的結(jié)構(gòu)域，即可用CH—X10—CH—X25－27—CH—X25－26—CH通式表示的4個連續(xù)的CH殘基［24］。17個BURP基因中只有11個基因包含完整的BURP結(jié)構(gòu)域，6條序列只包含其中的1或2個motif。其中CsBURP3缺motif2、motif6，CsBURP5和CsBURP8缺motif4，CsBURP6缺motif6，CsBURP12缺motif2，而CsBURP1不包含這3個motif。BURP的基因不包含BURP特征區(qū)域的情況在其他物種中也有出現(xiàn)，比如OsBURP01有2個保守的C殘基和一個CH基序，但有3個重復(fù)CH基序缺失。在OsBURP15中，2個保守的C殘基不存在［5］。

共線性分析發(fā)現(xiàn)，CsBURP14與CsBURP16、CsBURP11與CsBURP9分別具有共線性，具有共線性

的基因均在同一個亞家族中，說明其功能大致相似，且這2對基因的分化時間分別是74.07、68.71百萬年前，相差不大。但是這2對基因?qū)M織表達(dá)量和脅迫下的趨勢均相差較大，推測基因分化后功能也出現(xiàn)了分化。而舒茶早與油茶中的共線性基因?qū)Ψ只瘯r間范圍則為1.85～127.93百萬年，說明不同山茶屬物種間的差異較大。對茶BURP家族的啟動子進(jìn)行分析，這些順式作用元件包括ABRE（ABA響應(yīng)元件）和LTRE（低溫響應(yīng)元件），還有較多的光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件（赤霉素、脫落酸、生長素和茉莉酸甲酯）、逆境響應(yīng)元件和植物生長發(fā)育元件。這些順式作用元件包括很多與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，推測茶樹BURP家族中很多基因可以響應(yīng)生物脅迫或者非生物脅迫。

研究表明，BURP家族具有較強(qiáng)的組織表達(dá)特異性，這可能是由于BURP家族各個亞族的功能不同導(dǎo)致的。比如PG1β-like主要在生殖器官中表達(dá)［14］，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以看出，茶樹中的CsBURP13屬于此家族，在花中存在高表達(dá)的現(xiàn)象。茶樹中共有4個基因在嫩葉中高表達(dá)，其中2個屬于RD22-like，2個屬于PG1β-like家族，說明這2個家族在植物生殖發(fā)育中發(fā)揮作用。RD22-like亞家族的成員可能參與植物對非生物或生物脅迫的響應(yīng)，本研究的4個基因中3個都屬于RD22-like家族。根據(jù)熒光定量的結(jié)果可以看出，在冷脅迫下，除了CsBURP15在4 h表達(dá)量增高外，CsBURP14、CsBURP7和CsBURP10均受冷脅迫的負(fù)調(diào)控。在干旱處理下，CsBURP7最響應(yīng)PEG的脅迫，在前12 h持續(xù)增高，后續(xù)又急劇下降。RD22-like家族的3個成員在PEG的誘導(dǎo)下表達(dá)相似，均為先下降再上升后下降。在鹽脅迫下，則呈現(xiàn)出CsBURP7和CsBURP14、CsBURP15和CsBURP10兩兩相似的趨勢，整體均為下降趨勢，即這4個基因均受鹽脅迫的負(fù)調(diào)控。

在茶樹基因組中共鑒定出17個CsBURP，分為PG1β-like、BNM2-like、RD22-like 3個亞組。茶樹BURP基因家族的啟動子中含有大量非生物脅迫相關(guān)響應(yīng)元件，與茶樹響應(yīng)非生物脅迫相關(guān)。其中CsBURP15、CsBURP14、CsBURP7和CsBURP10均響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫與低溫脅迫。

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