曾娟妮劉筱伍偉明尹婷吳志榮李文華

【摘要】目的：探討外用單味動物藥促進創(chuàng)面愈合的機制。方法：將50只大鼠分為急性創(chuàng)面組、模型組、貝復濟組、美洲大蠊提取液組，用RT-PCR實驗方法，觀察大鼠皮膚修復組織VEGFmRNA的表達。結(jié)果：VEGFmRNA的表達在第5、7、11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復濟組及模型組（P<001）；在第5、7、11天，美洲大蠊提取液組、貝復濟組VEGFmRNA的表達量顯著高于模型組（P<001）；在第5、11天，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量有統(tǒng)計學差異（P<005）；第7天，肉芽組織生長期，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量無統(tǒng)計學差異（P>005）。結(jié)論：美洲大蠊提取液通過提高VEGFmRNA的表達來促進創(chuàng)面愈合。

【關鍵詞】美洲大蠊提取液；慢性難愈合創(chuàng)面；RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應）；基因表達

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）19-0064-03

慢性難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面在各種內(nèi)外因素作用下不能通過正常的愈合進程達到解剖和功能上的完整，從而進入一種病理性炎癥反應狀態(tài)，最終導致經(jīng)久難愈。藥理研究證明美洲大蠊提取物能促進肉芽組織生長，促進血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復各類潰瘍及創(chuàng)傷創(chuàng)面；抗感染、消除炎性水腫，提高機體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細胞，縮短創(chuàng)面愈合時間[1-2]。目前，美洲大蠊提取物被廣泛應用在創(chuàng)面修復、胃潰瘍、腫瘤等領域[3-4]。筆者前期將美洲大蠊提取物外用于肛管難愈合創(chuàng)面，并取得滿意療效[5]。但其促進慢性難愈合創(chuàng)面的機制尚未探討。因此本實驗研究從創(chuàng)面愈合機制為出發(fā)點，以RT-PCR為主要研究方法，從肉芽組織中新生血管為切入點，通過動物實驗從局部生長因子等角度探討美洲大蠊促進創(chuàng)面愈合的機制提供理論依據(jù)，并為中醫(yī)藥的外治提供新思路。

1材料與方法

11實驗動物及分組實驗動物SPF級50只大鼠，2月齡，體重200～250g，雌雄不限“均由湖南中醫(yī)藥大學動物中心提供，混合飼料單籠飼養(yǎng)”，50只大鼠隨機分組，先取12只建立大鼠急性愈合創(chuàng)面模型，其余38只建立大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型，慢性難愈合創(chuàng)面組再隨機分為模型組、貝復濟陽性組（國藥準字Z20013152，實驗全過程使用同批號藥物）、美洲大蠊提取液實驗組（國藥準字Z20000004，實驗全過程使用同批號藥物）。

12大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型建立參照付小兵等[6]全層皮膚缺損法經(jīng)改進制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。

13主要實驗試劑Trizol：Invitrogen；Real-time PCR mix：Promega A6001；DNA Marker：Fermentas；異丙醇：上海化學試劑公司；氯仿：上海化學試劑公司；引物：上海生工；Gold View核酸染料：上海生工；瓊脂糖粉：上海生工。

14主要實驗儀器及耗材臺式高速冷凍離心機：美國Thermo；核酸蛋白分析儀：德國eppendorf；PCR儀：德國 Biometra；凝膠成像分析儀：美國Bio-Rad；微量移液器：德國eppendorf。

15實驗方法及步驟

151引物設計從NCBI中下載以下基因序列，引物設計采用Primer50軟件，引物序列見表1。

152RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄從組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板，用針對目的基因設計合成的QPCR引物進行real-time PCR，以檢測組織中目的基因的表達。組織中總RNA抽提：①取50～100mg組織，每孔加入1000μL Trizol，吹打，室溫靜置5min；②每管加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置3min；4℃，12000rpm，離心15min；③從每管中吸取上清至另一新的15mL EP管。加入等體積異丙醇，混勻后室溫靜置20min；④4℃，12000rpm離心10min后，去上清；加入至少1mL 4℃預冷的75%乙醇，洗滌沉淀；⑤4℃，10000rpm離心5min，棄上清；4℃，10000rpm再次離心5min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）；⑥加入20μL RNase-free水，至完全溶解，備用。

15312%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。

154第一鏈cDNA合成 ①取10μg Total RNA加Nuclease-Free Water到無RNA酶的EP管中，混勻后離心，70℃溫浴10min，立即置于冰上；②加一下反應體系的其他試劑（冰上進行），混勻，短暫離心。③上述體系在42℃反應15min，然后在70℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活。④將得到cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

155普通PCR檢測（德國，biometra） 按下列比例配置反應體系：①2×Real-time PCR mix/2×PCR mix：10μL；②PCRmix；③cDNA模板：1μL ④上游引物：1μL；⑤下游引物：1μL；⑥ddH2O：7μL；⑦總體積：20μL；⑧擴增程序94℃，4min；94℃，40sec，60℃ 30sec，×40cycle。

16統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用SPSS160統(tǒng)計分析軟件處理，計量資料以均數(shù)加減標準差（x[TX-*3]±s）表示，行t檢驗，P<005為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2112%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度

22VEGF電泳結(jié)果

圖2注：GAPDH電泳圖， 第 1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復濟組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組。

圖3注：VEGF mRNA表達電泳結(jié)果，第1、2、3泳道是急性愈合創(chuàng)面組，4、5、6泳道是模型組， 7、8、9泳道是貝復濟組，10、11、12泳道是美洲大蠊提取液組，可反映出VEGFmRNA的表達量從高到低依次是急性愈合創(chuàng)面組、貝復濟組、美洲大蠊提取液組、模型組，在第7天，美洲大蠊提取液組與貝復濟組的VEGFmRNA的表達量無明顯差異。

23結(jié)果（見表2）

3討論

31本實驗研究發(fā)現(xiàn)在第5天、第7天、第11天，急性愈合創(chuàng)面組VEGFmRNA的表達量顯著高于美洲大蠊提取液組、貝復濟組及模型組（P<001），表明造模成功；在第5天、第7天、第11天，美洲大蠊提取液組、貝復濟組VEGFmRNA的表達量顯著高于模型組大鼠（P<001）；在第5天、第11天，美洲大蠊提取液組比貝復濟組VEGFmRNA的表達量稍低，但差異不明顯（P>005）；在第7天的肉芽組織生長期，美洲大蠊提取液組與貝復濟組VEGFmRNA的表達量無差異（P>005）；表明美洲大蠊提取液在創(chuàng)面肉芽生長期能誘導內(nèi)源性VEGF的基因表達，促進細胞外基質(zhì)（ECM）形成并減少效應T細胞在組織局部蓄積的作用，促進創(chuàng)面血液循壞、增強創(chuàng)面免疫力，從而促進創(chuàng)面修復、抑制瘢痕生長。

32血管生成可為創(chuàng)面的修復提供充足的氧分，有利于細胞的增殖；新生血管是肉芽組織的主要成分，肉芽組織是膠原沉積、改建的場所，因此，血管新生是創(chuàng)面修復過程中重要的一環(huán)[7]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種特異的直接作用于內(nèi)皮細胞的有絲分裂原，可以刺激體內(nèi)尤其是缺血部位的血管生成，是迄今為止已知的最強烈的促血管生長因子，它主要是通過啟動微血管發(fā)生的初始過程-出芽，并最終形成成熟的血管結(jié)構(gòu)[8]因此，VEGF在皮膚潰瘍愈合過程中起決定性作用。在慢性創(chuàng)面，由于VEGF表達較正常創(chuàng)面下調(diào)而導致血管生成的下降，被認為是慢性創(chuàng)面難愈合的重要原因[9]。基于此，本實驗通過檢測肉芽結(jié)果中VEGFmRNA的表達來探討單味動物中藥對促愈具有非常重要的意義，但美洲大蠊提取液在創(chuàng)面重塑期與貝復濟組表達有差異，那么它是否能減少瘢痕的形成有待于進一步探討。

參考文獻

[1]李莉，唐文華，徐月芳.康復新液治療頭面部燒傷36例效果觀察[J].齊魯護理雜志，2010，（16）：57-58.

[2]魏強，楊運芳.康復新液治療復發(fā)性阿弗他潰瘍112例近期療效觀察[J].中國健康月刊，2010，（29）：235-236.

[3]尹彬.康復新聯(lián)合奧美拉唑、阿莫西林膠囊三聯(lián)療法治療消化性潰瘍療效分析[J].中外醫(yī)學研究，2010，8（26）：17-18.

[4]劉宏宇.保留灌腸治療放射性直腸炎48 例療效觀察[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2010，7（3）：29-29.

[5]伍偉明，金麗穎，王真權(quán)，等. 康復新液治療肛管難愈合創(chuàng)面的臨床研究[J].中醫(yī)藥導報，2015，21（22）：71-73.

[6]付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創(chuàng)傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志，1999，16（5）：479-480.

[7]唐乾利，韓珊珊，付軍，等.MEBT/MEBO 對皮膚創(chuàng)面愈合過程中VEGF、bFGF、EGFmRNA表達影響的研究[J].右江民族醫(yī)學院學報，2012，34（5）：597-601.

[8]曹波，李志，李紹堂，等.芪榆油膏對肛瘺術后創(chuàng)面肉芽組織中VEGFmRNA表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（16）：236-238.

[9]彭湃.VEGF在慢性創(chuàng)面愈合中的作用及機理研究[D].廣州：第一軍醫(yī)大學，2004.

（編輯：穆麗華）