摘要：為探討大豆GmKCS27基因的作用，及其在大豆對(duì)逆境響應(yīng)中的生物學(xué)功能，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，從大豆中克隆得到1個(gè)編碼3-酮酯酰輔酶A合成酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）的基因GmKCS27，采用生物信息學(xué)方法分析其序列特征，并通過公共數(shù)據(jù)庫和qRT-PCR試驗(yàn)分析其表達(dá)模式，以期為GmKCS27基因的作用及大豆育種研究提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，GmKCS27基因長度為1 542 bp，編碼的蛋白含有513個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為9.19，為堿性蛋白。GmKCS27蛋白序列存在27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，且無信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最高（45.81%），其次是無規(guī)則卷曲（32.94%）、延伸鏈（16.18%），β-轉(zhuǎn)角最少（5.07%）；亞細(xì)胞定位預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)位于質(zhì)膜。GmKCS27在大豆各器官均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高、豆莢中次之、花中較低。非生物脅迫處理和定量分析顯示，該基因?qū)Ω珊岛望}脅迫表現(xiàn)出明顯的表達(dá)響應(yīng)。綜上所述，GmKCS27基因可能在大豆對(duì)鹽、干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：大豆；3-酮酯酰輔酶A合成酶；GmKCS27；基因克?。恍蛄刑卣?；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S188；S565.101" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0270-07

收稿日期：2023-12-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32101788）；聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：318052021）；聊城大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：S202310447030）。

作者簡介：宮玉杰（2000—），女，山東淄博人，碩士研究生，研究方向?yàn)榇蠖惯z傳育種。E-mail：3044727756@qq.com。

通信作者：孫永旺，博士，講師，研究方向?yàn)榇蠖惯z傳育種。E-mail：sunyongwang@lcu.edu.cn。

作為固著生長的生物，植物在生長發(fā)育過程中會(huì)遭受極端溫度、高鹽、土壤干旱等非生物脅迫以及害蟲、病菌、病毒等生物脅迫。在長期進(jìn)化過程中，為了應(yīng)對(duì)不利的環(huán)境條件，植物在生理、生化和細(xì)胞水平上發(fā)展了多種防御機(jī)制，如膜改變、抗氧化劑、角質(zhì)層蠟、滲透物合成、植物激素、苯丙烷衍生化合物的產(chǎn)生、細(xì)胞生長和增殖抑制以及氣孔關(guān)閉［1］。表皮蠟質(zhì)是覆蓋陸生植物表面并與外界環(huán)境接觸的第一道保護(hù)屏障，在非生物和生物脅迫下起著至關(guān)重要的保護(hù)作用［2］。近年來的研究表明，許多植物蠟質(zhì)合成相關(guān)基因參與調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的抗性。ECERIFERUM1（CER1）基因參與蠟質(zhì)生物合成途徑，cer1突變體呈現(xiàn)有光澤的綠色莖和改變的蠟烷烴生物合成［3-4］。水稻OsLKP2-OsGI互作負(fù)調(diào)控葉片表面蠟的積累，從而降低對(duì)干旱脅迫的抗逆性［5］。蘋果MdCER1-1能夠通過刺激蠟質(zhì)合成相關(guān)基因MdYPB5、MdCER3和MdKCS1的表達(dá)以及提高抗氧化酶活性等方式抵抗干旱脅迫［6］。過表達(dá)多漿旱生植物霸王ZxABCG11基因可以上調(diào)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，增加表皮蠟沉積，同時(shí)提高苜蓿的生物量產(chǎn)量、耐旱性和耐熱性［7］。

植物表皮蠟質(zhì)的主要成分是超長鏈脂肪酸（very long chain fatty acid，VLCFA）及其衍生物。VLCFA的生物合成由脂肪酸?；o酶A延長酶復(fù)合體（FAE）催化，該復(fù)合體包括3-酮?；o酶A合成酶（KCS）、β-酮酰基輔酶A還原酶（KCR）、β-羥基?；o酶A脫水酶（HCD）和反式-2，3-烯酰輔酶A還原酶（ECR）4種酶［8-9］。其中，KCS具有嚴(yán)格的底物特異性和組織表達(dá)特異性，是決定VLCFA最終鏈長和含量的限速酶［10-11］。

KCS在植物中一般以基因家族形式存在，如擬南芥中有21個(gè)［12-13］、水稻中有22個(gè)［14］、玉米中有26個(gè)［15］、大豆中有31個(gè)［16］。目前對(duì)擬南芥KCS基因家族生理和分子功能方面的研究最為深入，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系可將21個(gè)AtKCS分為8組［13］。研究表明，擬南芥KCS基因家族的不同成員在生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的生物功能，如AtKCS1、AtKCS2、AtKCS3、AtKCS4、AtKCS5、AtKCS6、AtKCS16、AtKCS20參與調(diào)節(jié)各類器官中角質(zhì)層蠟質(zhì)的合成［9，17-22］、AtKCS2、AtKCS9、AtKCS20負(fù)責(zé)調(diào)控根部木栓質(zhì)的合成和代謝［9，23-24］、AtKCS18調(diào)控?cái)M南芥種子油分的積累［25］、AtKCS10、AtKCS13對(duì)于表皮細(xì)胞的發(fā)育發(fā)揮著不可或缺的作用［26-27］。AtKCS4屬于α亞組，主要在莖和根的頂端分生組織、葉脈、成熟和萌發(fā)的花粉粒以及發(fā)育的胚中表達(dá)。AtKCS4定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，對(duì)C22和C24長度的VLCFA具有底物特異性，能夠催化合成C24和C26類型的VLCFA，敲除AtKCS4可抑制花粉管伸長和根的生長［20］。最近的一項(xiàng)研究表明，AtKCS4在高溫和黑暗條件下脂質(zhì)代謝調(diào)控中起關(guān)鍵作用［28］。

大豆（Glycine max）富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、碳水化合物，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界上最重要的糧食和油料作物之一。目前，我國大豆產(chǎn)量依然不足，對(duì)外依存度超過80%，為世界最大的大豆進(jìn)口國［29］。非生物脅迫嚴(yán)重影響著大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，大豆抗逆基因的挖掘及其調(diào)控機(jī)制解析對(duì)大豆育種具有重要意義。本研究通過同源比對(duì)，找到1個(gè)擬南芥AtKCS4的同源基因GmKCS27，對(duì)GmKCS27基因進(jìn)行克隆并分析GmKCS27編碼蛋白的理化性質(zhì)，研究非生物脅迫下其在根和葉片中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步解析GmKCS27基因在大豆對(duì)逆境響應(yīng)中的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2023年9月，將大豆Williams 82品種種植在聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院25 ℃恒溫培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)2周后進(jìn)行脅迫處理。分別使用100 mmol/L NaCl與10%聚乙二醇6000（PEG-6000）處理幼苗［30-31］。將其置于4 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理，置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行高溫脅迫處理。處理24 h后取大豆根和葉片，用錫紙包裹后立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。所有樣本均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 GmKCS27基因的克隆

使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit總RNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），從保存的大豆根部和葉片樣品中提取RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質(zhì)量。由NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索出GmKCS27基因的編碼區(qū)序列，使用在線工具DNAMAN設(shè)計(jì)目的基因的特異性引物，上游引物命名為 GmKCS27-F（5′-AGCTGGATCCATGACAGTGACGAGTGGAGAAGAAGA-3′）、下游引物命名為GmKCS27-R（5′-AGCTGGATCCCTATGTGACTATTTCCACAGGATACTT-3′），由北京擎科生物科技股份有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，提純后將目的片段連接到克隆載體（pCAMBIA1300），熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。經(jīng)帶有50 μg/mL Kanamycin抗性LB培養(yǎng)基篩選出多個(gè)陽性克隆，選擇單菌落進(jìn)行PCR檢測后送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

基因基本信息在NCBI上搜索獲得，使用ExPASy、SOPMA、Swiss-Model、NetPhos 3.1、Plant-mPLoc、STRING等在線分析工具對(duì)GmKCS27蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等進(jìn)行預(yù)測分析。具體網(wǎng)址和軟件名稱見表1。

1.4 GmKCS27基因表達(dá)模式分析

根據(jù)GmKCS27基因序列，經(jīng)DNAMAN軟件設(shè)計(jì)cDNA擴(kuò)增的上、下游引物，使用 Bio-Rad CFX96系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）擴(kuò)增。以基因GmACTIN作為參考基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算大豆根和葉片中GmKCS27基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmKCS27基因的克隆與測序

根據(jù)基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)GmKCS27基因特異性引物，以大豆根和葉片為材料提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將其作為模板對(duì)基因GmKCS27進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示片段大小約為1 500 bp（圖1），與預(yù)期基因片段大小相符，測序結(jié)果表明克隆得到的GmKCS27基因片段為1 542 bp，編碼513個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2 GmKCS27蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件ExPASy（https：//www.expasy.org/）對(duì)GmKCS27蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，蛋白分子式為C2 596H4 105N707O718S22，由20種常見的氨基酸組成，其中含量最高的為亮氨酸（Leu），占到總含量的12.3%；含量最低的為色氨酸（Trp），僅占總含量 的1.2%（表2）。原子總數(shù)為 8 148，分子量為57.41 ku，不穩(wěn)定系數(shù)為39.88，脂肪系數(shù)為100.16，推測其為穩(wěn)定蛋白。帶負(fù)電荷的殘基數(shù)量為44，帶正電荷的殘基數(shù)量為57，理論等電點(diǎn)為9.19，表明GmKCS27屬于堿性蛋白。

通過在線工具ExPASy的ProtScale，分析GmKCS27蛋白的親/疏水性，結(jié)果（圖3-A）顯示，蛋白序列長度為513 aa；在第56位達(dá)到疏水性最高峰，疏水指數(shù)為3.256； 在第308位達(dá)到親水性最高

峰，親水指數(shù)為2.778，總平均親水指數(shù)為0.029，因此推測GmKCS27蛋白屬于親水性蛋白。

使用在線軟件NetPhos 3.1對(duì)GmKCS27蛋白序列中氨基酸殘基潛在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖3-B）顯示：該蛋白可能存在27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括22個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)，13個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)，5個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)，表明該蛋白在發(fā)生磷酸化時(shí)，以絲氨酸的磷酸化為主。

2.3 GmKCS27蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線工具SOPMA對(duì)GmKCS27蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果（圖4-A）顯示：GmKCS27蛋白的多肽鏈組成成分中，α-螺旋最多，由235個(gè)氨基酸組成，占比為45.81%，其次是無規(guī)則卷曲，由169個(gè)氨基酸組成，占比為32.94%，延伸鏈有83個(gè)氨基酸，占比為16.18%，β-轉(zhuǎn)角最少，只有26個(gè)氨基酸，占比為5.07%。通過在線工具SWISS-MODLE對(duì)GmKCS27蛋白的513個(gè)氨基酸進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到3D結(jié)構(gòu)（圖4-B）。

2.4 GmKCS27蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位分析

利用Novopro在線工具對(duì)GmKCS27蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖5-A），說明該蛋白不屬于分泌型蛋白。使用在線軟件TMHMM對(duì)GmKCS27蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測分析，結(jié)果表明，該蛋白具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域（圖5-B）。利用在線工具Plant-mPLoc對(duì)GmKCS27蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白最有可能在質(zhì)膜上發(fā)揮其相應(yīng)作用。

2.5 蛋白互作分析

蛋白互作分析是一種重要的生物信息學(xué)分析方法，通過系統(tǒng)性地揭示生物體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用形成的網(wǎng)絡(luò)，從而了解這些蛋白的作用。使用STRING在線工具進(jìn)行了蛋白質(zhì)互作分析預(yù)測，結(jié)果顯示GmKCS27蛋白與Glyma.07G147000、Glyma.18G134800、Glyma.08G261100、Glyma.11G250400等蛋白存在互作關(guān)系（圖6）。使用Phytozome數(shù)據(jù)庫查詢各個(gè)互作蛋白的功能，結(jié)果（表3）顯示，GmKCS27與3-羥基酰基輔酶A脫水酶、3-酮?；o酶A合成酶等FAE組分存在互作，與預(yù)期相符。

2.6 GmKCS27的組織和脅迫表達(dá)模式分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫中下載GmKCS27在大豆各組織的FPKM數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，GmKCS27在根中表達(dá)量最高，其次是豆莢，在花中的表達(dá)量最低（圖7-A）。為了進(jìn)一步分析GmKCS27的生物學(xué)功能，對(duì)大豆植株進(jìn)行低溫、高溫、高鹽和干旱處理，并分析根和葉片中GmKCS27基因在不同脅迫下的相對(duì)

表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在高溫和低溫條件下，GmKCS27在葉片和根中的表達(dá)量與對(duì)照相比，均有顯著變化，但均未超過2倍。在高鹽條件下，GmKCS27在葉片和根中均極顯著上調(diào)表達(dá)，葉片中表達(dá)水平上調(diào)了近1倍，而根中表達(dá)水平上調(diào)了近29倍。在干旱條件下，葉片和根中GmKCS27相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)5、13倍（圖7-B）。

3 討論與結(jié)論

大豆含有豐富的植物蛋白，是食品糧油的主要來源，中國重要的糧食作物之一，至今已有5 000多年的歷史。但由于經(jīng)受多種不良環(huán)境脅迫， 尤其是

高溫、低溫、高鹽、干旱等嚴(yán)重影響了大豆的生長發(fā)育［32］。因此，提高大豆的抗逆性具有重要的生產(chǎn)意義［33］。在前人研究中，一些KCS基因已被證實(shí)在非生物脅迫響應(yīng)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用［24，34］。

本研究從大豆W82品種中克隆得到了GmKCS27基因，其序列大小為1 542 bp，分析結(jié)果表明，GmKCS27基因編碼513個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為9.19。GmKCS27蛋白存在27個(gè)磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，無信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占比最高；亞細(xì)胞定位預(yù)測該基因編碼的蛋白位于質(zhì)膜，GmKCS27在根中表達(dá)量最高，qRT-PCR結(jié)果表明，GmKCS27基因響應(yīng)干旱、鹽脅迫，初步判斷該基因?qū)Υ蠖沟姆巧锩{迫應(yīng)答起著重要作用。

已有研究表明，KCS基因參與調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫（干旱和鹽）以及植物激素的響應(yīng)［34］。Lian等研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫處理下1 h蘋果KCS12和KCS24上調(diào)5～10倍，KCS24基因的表達(dá)量在鹽脅迫處理下24 h后達(dá)到峰值，表達(dá)量上調(diào)12倍［35］，表明植物可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)KCS基因的表達(dá)水平來響應(yīng)干旱和鹽脅迫并增強(qiáng)耐受性［35］。與上述研究結(jié)果相似，本次試驗(yàn)中，在干旱脅迫下24 h大豆葉片和根中GmKCS27相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)5、13倍，在鹽脅迫處理下24 h大豆葉片中GmKCS27表達(dá)水平上調(diào)了近1倍，而根中表達(dá)水平上調(diào)了近29倍，據(jù)此可以推斷大豆經(jīng)受干旱和鹽脅迫時(shí)，可能通過調(diào)節(jié)KCS27基因的表達(dá)增強(qiáng)耐受性。BnKCS1-1、BnKCS1-2和BnCER1-2在甘藍(lán)型油菜中的過表達(dá)增加了葉片表面的蠟晶體密度，并且水分損失率降低，同時(shí)耐旱性增加，這在轉(zhuǎn)基因植物中得到增強(qiáng)［36］。本研究通過克隆GmKCS27基因，并對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行了初步分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了GmKCS27在不同非生物脅迫條件下的表達(dá)模式。研究了GmKCS27對(duì)非生物脅迫耐受性的響應(yīng)，研究結(jié)果為GmKCS27基因的作用及大豆育種研究提供了理論依據(jù)。

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