汪義龍+夏瑩萍+梁建生

摘要： 根據(jù)水稻數(shù)據(jù)庫中過氧化氫酶基因編碼序列設(shè)計(jì)引物，克隆水稻OsCATA基因全長序列，構(gòu)建無自激活活性的pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒，采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選水稻2周齡葉片 cDNA文庫。結(jié)果表明，對84個(gè)陽性克隆測序，比對分析得到13種可能與OsCATA基因存在相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白與葉綠素合成前體、脅迫相應(yīng)蛋白、核糖體蛋白、外膜蛋白、分泌蛋白、ATP酶和G蛋白β亞基等相關(guān)。不同時(shí)期過氧化氫酶基因表達(dá)分析顯示，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)較高，OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，OsCATC基因在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高。

關(guān)鍵詞： 水稻；OsCATA基因；過氧化氫酶；酵母雙雜交；表達(dá)分析

中圖分類號：Q786；S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0020-04

植物體內(nèi)的H2O2有雙重作用，低濃度的H2O2在干旱 [1]、鹽 [2]和重金屬 [3-4]等脅迫中，可以作為氧化還原信號分子，調(diào)控基因表達(dá)，產(chǎn)生一系列的防御機(jī)制來保護(hù)細(xì)胞。當(dāng)H2O2含量超過一定限度時(shí)，則導(dǎo)致氧化性損傷，甚至引起程序性死亡 [5-6]。

過氧化氫酶（catalase，EC 1.11.1.6，簡稱CAT）是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，催化H2O2生成H2O，同時(shí)釋放O2的反應(yīng)。該酶是由4個(gè)亞基組成的四聚體血紅蛋白，按照催化中心結(jié)構(gòu)差異分為2類：鐵卟啉酶和錳過氧化氫酶 [7]。過氧化氫酶主要分布在過氧化物酶體中，在乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中也有分布 [8-10]。已有研究者報(bào)道，從擬南芥 [11]、水稻 [12]、大麥 [13]、小麥 [14]、玉米 [15]、煙草 [16]、油菜 [17]和馬鈴薯 [18]中克隆到過氧化氫酶基因。對過氧化氫酶基因定位的研究中，Kamigaki等認(rèn)為C-末端氨基酸區(qū)域作為一個(gè)內(nèi)部定位信號在過氧化氫酶進(jìn)入過氧化物酶體過程中起著重要作用 [19]。

葉綠體和線粒體中產(chǎn)生的活性氧主要由ASC-GSH系統(tǒng)來清除，而過氧化物酶體中的活性氧主要由過氧化氫酶清除 [20]。在大麥 [21]、煙草 [22]和擬南芥 [23]CAT基因突變體的研究中，發(fā)現(xiàn)由于CAT基因的缺失，在強(qiáng)光或過氧化氫酶抑制劑的處理下，突變體表現(xiàn)出致死的表型。Foyer等認(rèn)為這種致死的表型是由于光呼吸產(chǎn)生的H2O2沒有被及時(shí)清除，在過氧化物酶體中積累，從而產(chǎn)生一系列氧化還原信號誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡 [24]。Lin等對水稻OsCATC突變體的研究發(fā)現(xiàn)，在不同條件處理下，其誘導(dǎo)的程序性死亡與細(xì)胞內(nèi)NO信號相關(guān) [25]。Queval等利用擬南芥[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]突變體在不同CO2濃度和不同光周期處理下，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]突變體程序性死亡的氧化還原信號與光周期的關(guān)系更大 [26]。

水稻數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中顯示水稻基因組中含有3個(gè)過氧化氫酶基因：OsCATA基因、OsCATB 基因和OsCATC基因。生物信息學(xué)分析表明水稻OsCATA基因與擬南芥[WTBX][STBX]CAT2[WTBZ][STBZ]基因cDNA同源性達(dá)到71%（與[WTBX][STBX]CAT1[WTBZ][STBZ]基因同源性為70%）。目前對篩選與水稻OsCATA基因相互作用蛋白的研究較少，鑒于OsCATA基因在細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號傳遞過程中的重要作用，對其功能研究具有重要意義，本研究利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與OsCATA基因相互作用的蛋白，分析過氧化氫酶基因在不同時(shí)期的表達(dá)，以期為了解OsCATA基因在氧化還原信號傳遞過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試水稻為日本晴（Oryza sativa L. spp. japonica cv. Nipponbare），種植于揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)田中，以四周的葉片為材料，提取總RNA，用于pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以不同時(shí)期的葉片為材料，提取總RNA，用于過氧化氫酶基因的表達(dá)分析。

1.2 試劑

總RNA提取試劑盒：RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo scientific）；熒光定量PCR試劑盒：SYBR Green SuperMix（BIO-RAD）；瓊脂糖電泳DNA回收試劑盒：AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（杭州愛思進(jìn)生物公司）；質(zhì)粒抽提試劑盒：質(zhì)粒小量制備試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；TA試劑盒：pMD19-T Simple Vector（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)制備為CaCl2法；酵母細(xì)胞感受態(tài)通過 LiAc 法制備；Taq DNA聚合酶：Thermo Scientific DreamTaq Green DNA聚合酶；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。日本晴水稻2周齡葉片cDNA文庫已連接在pGADT7-Rec載體上，并轉(zhuǎn)化酵母Y187菌株，由趙淑玲博士惠贈(zèng) [27]；酵母AH109菌株購自北京拜爾迪公司；雙雜交質(zhì)粒：pGBKT7，pGADT7 購自C lontech公司；酵母 YPDA 培養(yǎng)基、缺陷型培養(yǎng)基購自北京泛基諾公司；X-α-gal 購自Inalco公司。

1.3 水稻總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒說明書，提取4周齡的日本晴葉片的總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，以5 μL的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于pGBKT7-OsCATA誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。提取不同時(shí)期日本晴葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于過氧化氫酶基因的表達(dá)分析。

1.4 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在水稻數(shù)據(jù)庫中搜索OsCATA基因（LOC_Os02g02400）的編碼序列，用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的水稻葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增OsCATA基因的編碼序列。反應(yīng)體系20 μL，其中引物OsCATA_F和OsCATA_R各0.5 μL，10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，模板cDNA 1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳、回收、克隆入pMD19-T質(zhì)粒載體，即pMD19T-OsCATA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，PCR鑒定為陽性的菌落送公司測序。將pMD19T-OsCATA 和pGBKT7質(zhì)粒分別用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后，經(jīng)20%瓊脂糖凝膠電泳、回收目的片段、連接構(gòu)建成完整的 pGBKT7-OsCATA 重組質(zhì)粒。

1.5 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒自激活及毒性檢測

將誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA和獵物空質(zhì)粒pGADT7-EV共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，涂布SD/-Trp/-Leu平板，30 ℃培養(yǎng)4～5 d，挑取SD/-Trp/-Leu平板上生長較好的單菌落，用50 μL、0.9% NaCl溶液重懸。取10 μL重懸菌液分別滴加在SD/-Trp/-Leu/-His/X-α-gal和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal缺陷型培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng)3～4 d，觀察生長情況，確定誘導(dǎo)蛋白是否具有自激活。

1.6 cDNA文庫篩選及陽性克隆鑒定

將誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，篩選轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187的水稻2周齡cDNA文庫，涂布50個(gè)平板，按Clontech公司酵母雙雜交操作手冊檢測雜交效率，在SD/-Trp/-Leu/-His/+X-α-gal缺陷型培養(yǎng)基上篩選與OsCATA基因存在相互作用的蛋白質(zhì)，初篩的陽性克隆需要重新劃線進(jìn)一步確認(rèn)。挑取已驗(yàn)證為陽性的酵母菌落，使用pGADT7基因引物AD/T7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收并測序，對測序結(jié)果進(jìn)行整理分析。

1.7 水稻不同時(shí)期葉片過氧化氫酶基因的表達(dá)分析

以水稻數(shù)據(jù)庫中的過氧化氫酶基因編碼序列為參照，用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)OsCATA、OsCATB和OsCATC基因定量PCR引物（表1）。以幼苗期、分蘗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、揚(yáng)花期、乳熟期和完熟期等8個(gè)時(shí)期的水稻葉片cDNA為模板，熒光定量PCR擴(kuò)增水稻過氧化氫酶基因，進(jìn)行表達(dá)量分析。反應(yīng)體系20 μL，其中上下游引物各0.5 μL，定量PCR混合液10 μL，模板cDNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；加溶解曲線程序，導(dǎo)出數(shù)據(jù)使用ABI 7300儀器分析軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建誘導(dǎo)重組質(zhì)粒

以引物OsCATA_F和OsCATA_R（表1）PCR擴(kuò)增水稻OsCATA 基因全長序列，電泳、回收并克隆到pMD19-T載體中，將測序正確的pMD19T-OsCATA和pGBKT7質(zhì)粒經(jīng) NdeⅠ 和BamHⅠ雙酶切后，回收目的片段，連接構(gòu)建成完整的誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGBKT7-OsCATA，重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示。

2.2 誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的自激活及毒性檢測

2.3 水稻cDNA文庫的篩選結(jié)果

以pGBKT7-OsCATA質(zhì)粒為誘導(dǎo)蛋白，篩選水稻2周齡葉片cDNA文庫，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)SD/-Trp/-Leu/-His/+X-α-gal培養(yǎng)板初步篩選并重新劃線確認(rèn)后，共獲得84個(gè)陽性克隆，挑取陽性酵母菌落進(jìn)行菌落PCR，電泳、回收目的條帶送公司測序。將測序結(jié)果在水稻數(shù)據(jù)庫中比對搜索，表2列出了陽性克隆測序后比對出的可能存在相互作用的蛋白的基因號和注釋。

2.4 不同時(shí)期水稻過氧化氫酶基因的表達(dá)分析

從圖3可見，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)略高，在揚(yáng)花期時(shí)表達(dá)最低，是幼苗期的18%。OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，是幼苗期的1.5倍左右。OsCATC基因的表達(dá)在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高，在乳熟期時(shí)表達(dá)最低，是幼苗期的61%。

3 討論

本研究應(yīng)用Clontech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)，構(gòu)建 pGBKT7-OsCATA 誘餌重組質(zhì)粒，篩選水稻2周齡葉片cDNA文庫，通過對84個(gè)陽性克隆的測序和序列比對分析，得到13種可能存在相互作用的蛋白。煙草 [22]和擬南芥 [23]CAT基因缺失材料，表現(xiàn)出顯著的表型，即葉片出現(xiàn)白斑，Lin等在篩選[CM（25]水稻NO信號相關(guān)突變體時(shí)，發(fā)現(xiàn)了OsCATC突變體，該突變體葉片也出現(xiàn)顯著的白斑，認(rèn)為其與NO信號介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡相關(guān) [25]。本研究在篩選OsCATA基因互做蛋白時(shí)，篩選出2個(gè)與葉綠素合成前體相關(guān)的蛋白，PSⅡ反應(yīng)中心W蛋白和磷酸-2-脫氫-3-脫氧庚糖酸醛縮酶，為進(jìn)一步研究過氧化氫酶與葉綠素合成、葉片細(xì)胞程序性死亡之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。H2O2是植物細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的重要組成部分，與植物細(xì)胞衰老與程序性死亡 [28]、氣孔關(guān)閉 [29]、根的生長 [30]、細(xì)胞壁的發(fā)育 [31]、柱頭與花粉的發(fā)育 [32]以及系統(tǒng)獲得抗性 [33]等密切相關(guān)。轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶基因缺失的煙草植株，對病原菌應(yīng)答的敏感性顯著提高 [34]，本研究中篩選出2個(gè)與脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白——含有應(yīng)激蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白和脅迫響應(yīng)蛋白，有助于分析H2O2和過氧化氫酶在脅迫應(yīng)答信號網(wǎng)絡(luò)中的作用。另外還篩選出與 OsCATA 可能存在相互作用的蛋白包括外膜蛋白OMP85家族，分泌載體相關(guān)膜蛋白，40S核糖體蛋白、含有1，3-β-葡聚糖合成酶結(jié)構(gòu)域的蛋白、液泡ATP合酶亞基、賴氨酸酮戊二酸還原酶反式剪接相關(guān)因子、G蛋白β亞基WD結(jié)構(gòu)域和含TPR結(jié)構(gòu)域的蛋白等。

不同時(shí)期過氧化氫酶基因的表達(dá)分析說明，不同時(shí)期過氧化氫酶基因表達(dá)差異較大，OsCATA基因在幼苗期和抽穗期表達(dá)略高，OsCATB基因在乳熟期和完熟期中表達(dá)較高，OsCATC 基因的表達(dá)在幼苗期和揚(yáng)花期表達(dá)較高，即不同時(shí)期通過表達(dá)不同過氧化氫酶基因來清除體內(nèi)過多的H2O2。

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