孫海燕++安澤偉++李琴等

摘要：從三色堇花瓣中克隆了1個(gè)花色素合成結(jié)構(gòu)基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為VwDFR。VwDFR cDNA全長(zhǎng)為1 340 bp，編碼347個(gè)氨基酸組成的蛋白，與胡楊的DFR序列具有較高的序列一致性。VwDFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域，屬于SDR超基因蛋白家族成員。VwDFR基因在三色堇不同組織中的表達(dá)存在明顯差異，在初花期的花瓣中表達(dá)量最高，且色斑區(qū)高于非色斑區(qū)。結(jié)果說(shuō)明，VwDFR可能與三色堇花色形成有關(guān)。此結(jié)果為深入研究三色堇花色形成奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：三色堇；DFR；基因克隆；表達(dá)分析；花色素合成

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0034-04

收稿日期：2015-05-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31060265、31260488）；海南大學(xué)中西部計(jì)劃學(xué)科建設(shè)（編號(hào)：ZXBJH-XK008）。

作者簡(jiǎn)介：孫海燕（1986—），女，重慶開(kāi)縣人，碩士，從事園林植物資源與遺傳改良。E-mail：shy0228@sina.com。

通信作者：王健，男，湖北宜昌人，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事園林植物分子生物學(xué)。Tel：0898-66267907；E-mail：wjhnau@163.com。花形態(tài)的多樣性是大自然最美麗的禮物之一，總是令生物學(xué)家著迷。生物學(xué)家對(duì)產(chǎn)生花卉多樣性的發(fā)育遺傳機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)金魚(yú)草和矮牽牛是探索花對(duì)稱(chēng)性[1]、花色[2-4]、花瓣紋理[5]的優(yōu)秀模式植物。隨著研究的深入，花斑的形成逐漸被學(xué)者關(guān)注。植物花斑是指在其花瓣大小、形態(tài)和位置上基本固定的色斑[6]，主要是由于花色素在特定區(qū)域積累形成的，如三色堇黃底紫斑品種Rhinegold和白底紫斑品種Mont Blanc的花斑部分的組成色素是飛燕草素和矢車(chē)菊素[7-8]。因而，花色素在花瓣上積累的分子機(jī)理是花斑形成原因的研究重點(diǎn)。

花青素又稱(chēng)花色素，屬類(lèi)黃酮化合物，是一類(lèi)植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物細(xì)胞液泡中。自然界中主要有6類(lèi)花色素，即天竺葵色素（pelargonidin）、芍藥花色素（peonidin）、矢車(chē)菊素（cyanidin）、牽?；ㄉ兀╬etunidin）、飛燕草色素（delphinidin）和錦葵花色素（malvidin），其生物合成和調(diào)控已有較深入的研究?；ㄇ嗨厣锖铣赏緩降那绑w物質(zhì)是 4-香豆酰CoA與3-丙二酰CoA，最后形成花的顏色涉及的一系列酶有：查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI），黃烷酮3-羥化酶（F3H）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖類(lèi)黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）等[9-10]。

二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）是花青素生物合成中類(lèi)黃酮途徑的第一個(gè)酶，負(fù)責(zé)將3種二氫黃酮醇（DHK、DHQ和DHM）還原為無(wú)色花色素苷，缺失DFR活性的突變體會(huì)產(chǎn)生白色。在一些植物中，DFR有嚴(yán)格的底物特異性，不能利用二氫堪非醇（DHK）生產(chǎn)天竺葵素，因而缺乏橙/磚紅色。Johnson等將蘭屬DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛后，不能有效合成天竺葵素，而將非洲菊中能有效還原DHK的DFR導(dǎo)入到白色矮牽牛中，得到了磚紅色花朵[11]。可見(jiàn)，圍繞DFR基因進(jìn)行基因操作也可以改造花色。

三色堇（Viola×wittrockiana Gams）是堇菜科堇菜屬的一種多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色豐富、明艷，花期長(zhǎng)，是花壇、花境、盆花等常用早春花卉，有“花壇皇后”之美譽(yù)，在園林綠化方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。鑒于DFR基因?qū)χ参锷实男纬煞浅ｊP(guān)鍵，分離三色堇花瓣中DFR基因并研究其表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，將有助于闡明DFR基因在三色堇花斑形成過(guò)程中的作用。本研究擬從三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步對(duì)VwDFR進(jìn)行生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究VwDFR在三色堇不同組織中的表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1植物材料

本試驗(yàn)材料為花色黃底黑斑的三色堇（Viola × wittrockiana Gams）品種，種植于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院基地。

1.2菌株與試劑

大腸桿菌Escherichia coli JM109菌株購(gòu)自天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1642）購(gòu)自Fementas公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Sigma公司；LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ購(gòu)自大連寶生物公司；引物合成和測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3方法

1.3.1總RNA的提取與cDNA第一鏈合成三色堇花瓣總RNA的提取采用改良Trizol法[12]，其他組織的RNA提取方法按照常規(guī)方法進(jìn)行。cDNA第一鏈合成使用Fementas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，操作步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.2三色堇ANS、DFR基因全長(zhǎng)cDNA克隆比對(duì) GenBank 上登錄的不同物種的DFR基因，依據(jù)其保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到其保守區(qū)片段，然后根據(jù)擴(kuò)增得到的序列分別設(shè)計(jì)3′-RACE和5′-RACE引物（表1）擴(kuò)增3′和5′端片段，具體方法參照文獻(xiàn)[13]。根據(jù)測(cè)序所得DFR基因的3′和5′端序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，獲得其全長(zhǎng)cDNA拼接序列。根據(jù)所得的全長(zhǎng)拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），使用Taq plus DNA polymerase進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增，引物終濃度為0.5 μmol/L，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，克隆至pMD8-T載體上，測(cè)序確認(rèn)。

1.3.3生物信息學(xué)分析利用NCBI在線Blast工具和DNAMAN軟件對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析和開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)；利用在線軟件Expasy進(jìn)行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析；利用MEGA 5.10軟件，以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（qRT-PCR）采用羅氏公司的LightCycler 2.0系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR，分析VwDFR基因在初花期根、莖、葉、花不同組織中的表達(dá)情況。以actin基因作為內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行定量分析，對(duì)樣品進(jìn)行均一化。反應(yīng)總體系為20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和上下游混合引物0.6 μL及ddH2O 7.4 μL；反應(yīng)程序95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。靶基因和內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，數(shù)據(jù)處理采用系統(tǒng)自帶軟件。

2結(jié)果與分析

2.1VwDFR的克隆

搜索比對(duì)其他植物DFR基因序列并找出保守區(qū)域，利用PCR擴(kuò)增得到這個(gè)基因片段的特異性條帶，長(zhǎng)度為241 bp（圖1-A）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)它們均缺失5′和3′端，利用5′和3′RACE技術(shù)分別經(jīng)過(guò)2輪擴(kuò)增，得到DFR的3′末端片段約793 bp（圖1-B）及5′末端序列約246 bp（圖1-C）。上述片段進(jìn)行Blast分析，確認(rèn)與其他植物DFR同源。根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接后，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到1 340 bp全長(zhǎng)cDNA片段（圖1-D）。

2.2序列分析

序列分析發(fā)現(xiàn)，三色堇VwDFR基因含有1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，起始密碼子在85位，終止密碼子在1 128位。其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 044 bp，編碼347個(gè)氨基酸（圖2）。經(jīng)氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該基因蛋白屬于SDR蛋白家族，是SDR superfamily超基因家族中的一個(gè)，該基因家族有2個(gè)高度保守功能結(jié)構(gòu)域，NADP 的結(jié)合功能域和底物特異結(jié)合功能域。如圖3所示，VwDFR基因在這2個(gè)功能域上是高度保守的。利用在線軟件Expasy分析該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，VwDFR蛋白的分子量為8.61 ku，等電點(diǎn)為5.08，不穩(wěn)定系數(shù)為40.29，平均親水系數(shù)為0.731，屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。此外，跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，VwDFR是跨膜蛋白。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAman軟件，根據(jù)VwDFR基因編碼的氨基酸序列，在NCBI蛋白序列庫(kù)中進(jìn)行同源檢索和比較得知，該蛋白與胡楊（Populus euphratica）、可可（Theobroma cacao）、甜橙（Citrus sinensis）、蘋(píng)果（Malus domestica）等15種其他植物DFR蛋白有73%～83%的同源性，其中與胡楊DFR蛋白同源性最高，為83%。將VwDFR與這15條DFR蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)并利用Mega 5.10構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4），發(fā)現(xiàn)VwDFR 與楊柳科胡楊的 DFR 親緣關(guān)系最近。從進(jìn)化樹(shù)還可

以看出，16條DFR蛋白序列明顯地聚為2個(gè)類(lèi)簇，其中 VwDFR 與甜橙、可可、胡楊等雙子葉植物的DFR聚為一支，而其他單子葉植物的DFR聚為一支。總的來(lái)看，同為雙子葉的三色堇DFR基因，與雙子葉植物的親緣關(guān)系更近一些，因此DFR蛋白序列的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律。

2.4三色堇VwDFR基因熒光定量表達(dá)分析

在三色堇開(kāi)花期進(jìn)行取樣，從同一株植株的根、莖、葉、花中分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析三色堇DFR基因在根、莖、葉、花中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖5）表明，VwDFR在三色堇的根、莖、葉和花中均有表達(dá)，但表達(dá)水平具有明顯差異。其中，在花色素大量積累的初花期花瓣中表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低，說(shuō)明VwDFR主要在花瓣中表達(dá)，且色斑區(qū)的表達(dá)水平高于非色斑區(qū)。

3討論與結(jié)論

本研究中利用RT-PCR同源克隆和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從三色堇的花瓣中克隆得到花青素合成結(jié)構(gòu)基因VwDFR全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)對(duì)其編碼的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析表明，三色堇VwDFR編碼蛋白N端存在2個(gè)高度保守功能結(jié)構(gòu)域-NADP 的結(jié)合功能域和底物特異結(jié)合功能域，是植物SDR superfamily超基因家族蛋白的典型特征。本研究得到的VwDFR基因與其他植物DFR氨基酸序列的一致性較高，其中與楊柳科的胡楊DFR氨基酸序列一致性最高，為83%。且系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，VwDFR和胡楊的DFR親緣關(guān)系較近，而與單子葉植物的鳶尾、百合和小麥等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明VwDFR基因的進(jìn)化基本符合植物分類(lèi)學(xué)的進(jìn)化規(guī)律。

本研究中對(duì)三色堇不同組織器官的VwDFR熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在初花期的花瓣中表達(dá)量最高，這與李琴等的研究結(jié)果[14]一致，說(shuō)明VwDFR是三色堇花色素合成的關(guān)鍵基因。此外，VwDFR在根中的表達(dá)量也較高，這可能與DFR基因的表達(dá)存在組織特異性有關(guān)[15]。

花色素結(jié)構(gòu)基因是花色素生物合成的基礎(chǔ)，現(xiàn)有的研究表明，植物花瓣上的花斑是由于花色素基因的差異性表達(dá)而形成的[16]。DFR基因首次從玉米（Zea mays）和金魚(yú)草（Antirrhinum majus）中分離得到，后來(lái)相繼從其他多種植物（如擬南芥、三葉草、玫瑰、蘭花、非洲菊等）中克隆出DFR[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)一些植物花瓣上花斑的形成與DFR基因的差異性表達(dá)相關(guān)，如蝴蝶蘭小丑型品種中其花瓣上大塊的紫色色斑，主要由于是DFR基因在色斑區(qū)特異性表達(dá)導(dǎo)致[20]；在文心蘭的花瓣和萼片中，其色斑形成的基礎(chǔ)是因?yàn)镺gCHI 和OgDFR基因表達(dá)被遏制[21]；而在百合品種Sorbonne中，LhDFR在無(wú)色斑的邊緣區(qū)域表達(dá)水平很低，但在花被片的色點(diǎn)部位以及有色斑的中心部位高度表達(dá)[22]。

綜上所述，筆者初步推測(cè)本試驗(yàn)所克隆得到的VwDFR基因可能在三色堇花瓣中存在差異性表達(dá)，三色堇花瓣花色及色斑的形成可能與VwDFR的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為深入揭示三色堇花色及色斑形成奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為創(chuàng)新花色奠定基礎(chǔ)。

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