史靈敏+張斌+丁漢鳳

摘要：本試驗從濟麥22幼葉中克隆得到三個小麥防御素基因TaPDF（Triticum aestivum defensin），分別命名為TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34（GenBank登錄號分別為BT009185、BT009167和BT009022）。序列分析發(fā)現，三個防御素基因各自含有一個長度為243、249 bp和225 bp的開放閱讀框 （open reading frame， ORF），依次編碼長度為80、82個和74個氨基酸的蛋白。成熟蛋白的分子量均約為5.5 kD，等電點均大于7，含有8個保守的Cys殘基。保守結構域分析發(fā)現，TaPDF32含有一個γ-硫堇功能結構域，TaPDF33和TaPDF34均含有一個Knot1功能結構域，兩者均是植物防御素的典型結構域，因此這三個TaPDF屬于典型的植物防御素蛋白。SWISS-MODEL在線軟件分析表明，三個TaPDF的三級結構均由三股反平行的β-折疊和一個α-螺旋組成。系統(tǒng)進化分析表明，TaPDF32、TaPDF33的氨基酸序列與玉米、粟米的防御素相似性較高，而TaPDF34與大豆的防御素相似性較高，但均與已經報道的小麥防御素相似性較低，表明TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34是小麥三個新的防御素蛋白。熒光定量RT-PCR分析發(fā)現，TaPDF32、TaPDF33基因在小麥葉片中表達量最高，種子次之，根中最低；TaPDF34基因在葉、種子和根中的表達量基本相同。

關鍵詞：小麥；植物防御素；基因克隆；序列分析；組織特異性表達

中圖分類號：S512.101 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0001-08

Abstract Three Triticum aestivum defensin （TaPDF） genes， TaPDF32， TaPDF33 and TaPDF34 （GenBank accession No. BT009185， BT009167 and BT009022）， were cloned from the young leaves of Jimai 22 cultivar. Sequence analysis showed that each had an open reading frame of 243， 249 bp and 225 bp， which encoded the proteins with 80， 82 and 74 amino acids respectively. The mature proteins， with the estimated molecular masses of all about 5.5 kD and the isoelectric points all higher than 7， each contained eight conservative cysteine residues. Conserved domain analysis found that TaPDF32 contained a strictly conserved gamma-thionin domain， while TaPDF33 and TaPDF34 each had a Knot1 function domain. Both of the domains are the typical characteristics of plant defensin. Thus， the three TaPDFs all belong to typical plant defensin proteins. Study of the three dimensional structure using SWISS-MODEL showed that all of them contained a triple-stranded anti-parallel β-sheet and an α-helix stabilized by four disulfide bridges. Phylogenetic analysis showed that TaPDF32 and TaPDF33 were close to defensins of Zea mays and Setaria italica， while TaPDF34 was close to Clycine max defensin. But they all owned low similarities with the other reported wheat defensins， which indicated that TaPDF32， TaPDF33 and TaPDF34 were three new wheat defensins. Real-time PCR analysis revealed that TaPDF32 and TaPDF33 genes had the highest expression level in leaves， followed by seeds， and the lowest level in roots. Whereas TaPDF34 expressed basically consistent in all tissues.

Keywords Triticum aestivum； Plant defensin； Gene cloning； Sequence analysis； Tissue-specific expression

植物防御素是植物天然防御系統(tǒng)的重要成員[1，2]。與昆蟲和動物的抗細菌特性不同，植物防御素具有抵御真菌（如尖孢鐮刀菌、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌和白色念珠菌等）感染的特性[1，3，4]。此外，植物防御素還受環(huán)境脅迫的誘導，如干旱[5，6]、寒冷[7，8]和信號分子（茉莉酸甲酯、乙烯和水楊酸）[9，10]等均可誘導防御素基因表達。植物防御素分子量約為5 kD，由45～50個氨基酸組成[11]，其典型的三級結構是由一個α-螺旋和三股反平行的β-折疊構成的CSαβ模體結構，以8個保守的半胱氨酸殘基形成4個分子內二硫鍵來穩(wěn)定其三級結構[12，13]。大部分植物防御素含有4個二硫鍵，但是矮牽牛的防御素PhD1和PhD2含有10個半胱氨酸殘基，形成5對二硫鍵[14，15]。盡管不同植物防御素的氨基酸序列差異很大，但其三級結構高度保守[16]。通過對其三維結構進行修飾或替換某個氨基酸可以改善其生物功能或賦予新的生物活性[17]。

植物防御素以前體蛋白的形式表達，根據其前體蛋白的結構特點可以分為兩類，第一類含N端信號肽序列和C端成熟防御素結構域，通過粗面內質網經折疊后進入分泌途徑；第二類比第一類多了一個C末端結構域，該結構域參與了防御素蛋白的液泡定位并在分泌途徑中起保護細胞的作用[14]。研究發(fā)現，第二類植物防御素存在于茄科植物和禾本科植物中[14，18，19]。Peter等對來自花煙草的兩類防御素進行研究后發(fā)現，第二類防御素比第一類防御素抗禾谷銹病真菌的效果更好[20]。

植物防御素在植物的各個器官中都有表達，但其表達模式各不相同。大部分擬南芥防御素類似基因DEFL在花序中表達，只有少數在根中表達；而蒺藜苜蓿DEFL主要在固氮根瘤中表達[21，22]。在觀賞植物花煙草和矮牽?；ㄖ校ǘ浒l(fā)育的早期階段防御素含量很高，花煙草NaD1的轉錄產物主要積累在花瓣、萼片、花藥和花柱的最外層細胞，這與抵抗病原體、保護生殖器官的作用是一致的[14]。綠豆防御素基因VrCRP定位在種皮的薄壁細胞中[23]；甘藍防御素基因tags118在花中特異表達[24]；而甜椒防御素基因主要在果實中特異表達[25]。蘿卜防御素基因Rs-AFP1和Rs-AFP2主要在種子萌發(fā)時特異表達，而Rs-AFP3和Rs-AFP4在葉片受到病原菌感染時特異表達[26]。 綜上所述，植物防御素主要在種子、花朵、果實、葉片等器官中表達，在豆科植物中主要在其根瘤處表達，這些都是易受病原菌感染而又非常重要的器官。

植物防御素具有廣譜抗菌性[1，3，4]，在植物抗病蟲害基因工程中有重要的應用價值[1]。冬小麥中冷誘導防御素基因TAD1在小麥中過度表達可增強小麥對雪霉病和赤霉病的抗性[7，8]。將油菜中的防御素基因和幾丁質酶基因在加拿大油菜中過表達提高了其對菌核病的抗性[27]。在水稻中持續(xù)表達蘿卜防御素基因Rs-AFP2能夠抑制稻瘟病菌和立枯絲核菌的生長[28]。除了天然的防御素，化學合成的防御素類似物也能表現出同樣的作用。BTD-S是基于狒狒θ-防御素（BTD）設計合成的非環(huán)狀θ-防御素類似物，將其轉化到擬南芥中，可使轉基因株系表現出對大麗輪枝菌的抗性[29]。此外，植物防御素還具有抑制離子通道、抑制蛋白合成、抑制胰蛋白酶和α-淀粉酶活性以及耐重金屬的作用[30，31]，還能調節(jié)植物的生長發(fā)育[32]和抑制癌細胞生長[33]，表明植物防御素具有廣闊的應用前景。

防御素有一個很大的基因家族。在蒺藜苜蓿和擬南芥中分別發(fā)現了300多個DEFL基因[34，35]，而在水稻中僅發(fā)現了90多個DEFL基因[36]，目前在NCBI核酸數據庫中分別能夠檢索到17條和43條玉米及小麥的防御素序列，其中31條小麥防御素序列為本實驗室提交。本研究基于GenBank中登錄的小麥防御素序列，從濟麥22幼葉中克隆了3個小麥防御素基因，經PCR擴增和測序驗證無誤后，對其進行了生物信息學分析和Real-Time PCR 組織特異性表達分析，為進一步的功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為濟麥22，種植于山東省農業(yè)科學院科研示范區(qū)。

1.1.2 試劑 植物總RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質粒DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，反轉錄試劑盒為Fermentas產品，DNA聚合酶和T4 DNA 連接酶為TaKaRa產品，其他常規(guī)化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 載體及菌株 pEASY-T3克隆載體、大腸桿菌（Escherichia coil） Trans1-T1 Phage Resistant 化學感受態(tài)細胞均購于全式金。

1.1.4 引物的合成 基于GenBank登錄號為BT009185（TaPDF32）、BT009167（TaPDF33）和BT009022（TaPDF34）的序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計目的基因和小麥內參基因 β-Actin的特異性引物（表 1）。引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥總RNA的提取、純化及反轉錄 取適量濟麥22的根、幼嫩葉片及種子，用TIANGEN植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。按照 Fermentas 公司的反轉錄試劑盒操作步驟進行反轉錄，得到完整的cDNA。所有 cDNA 樣品均存于 -20℃ 冰箱中備用。

1.2.2 TaPDF基因克隆 以小麥幼葉cDNA為模板，利用表1中的上下游引物分別克隆TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34基因。PCR 擴增反應程序為： 95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72℃終延伸 10 min。PCR 產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將與目的基因大小一致的 PCR 產物回收，回收的目的片段連入pEASY-T3克隆載體并測序。

1.2.3 TaPDF蛋白生物信息學分析 利用NCBI數據庫ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi） 在線分析獲得TaPDF基因的開放閱讀框。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線程序計算TaPDF蛋白的理化參數。通過網站http：//www.cbs.dtu.dk/services/上的在線軟件SignalP 4.1、TMHMM 2.0和TargetP 1.1對目的蛋白進行信號肽、跨膜區(qū)及亞細胞定位分析。利用在線網站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi對目的蛋白的保守結構域進行分析。利用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）完成對目的蛋白三級結構預測。利用NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的在線工具BLASTP對目的蛋白的同源性進行比對分析。用在線軟件ESPript3.0 （http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php） 進行氨基酸序列的比對，并通過MEGA5.0軟件中鄰近相連法 （neighbor-joining， NJ） 構建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap重復1 000次）。

1.2.4 實時定量PCR分析 取等量小麥各組織cDNA模板，依次稀釋6個梯度，每個梯度稀釋5倍，利用小麥內參基因β-Actin 及TaPDF基因的特異性引物進行擴增，每個反應設置3個重復，根據Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上得到的Ct值繪制標準曲線，得到斜率K和線性相關系數r，根據公式E=5-1/K-1，計算得出擴增效率。熒光定量的步驟按照SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行操作，反應體系含cDNA 50 ng，2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。擴增程序為：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，42個循環(huán)。反應結束應用Bio-Rad iQ5 軟件分析擴增曲線及熔解曲線。2-ΔΔCt法[37]計算TaPDF基因在不同組織中的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 TaPDF基因克隆

以濟麥22幼葉cDNA為模板，用TaPDF基因特異性引物（表1）進行PCR擴增，得到三條擴增片段（圖1）。經測序，擴增片段長度分別為313、335 bp和271 bp，與預期的擴增片段長度一致，分別命名為TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34。三個基因各自含有一個長度為243、249 bp和225 bp的開放閱讀框，其編碼蛋白分別含有80、82和74個氨基酸。

2.2 TaPDF蛋白的信號肽與保守結構域分析

信號肽分析發(fā)現，TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34蛋白N端均含有信號肽，長度分別為31、33個和27個氨基酸。通過預測三者的跨膜區(qū)發(fā)現，三者均不含跨膜區(qū)。TargetP 1.1軟件分析發(fā)現，TaPDF32、TaPDF33、TaPDF34被定位到分泌途徑，推測這三個TaPDF均為分泌型蛋白。

根據Smart軟件預測TaPDF32、TaPDF33和TaPDF34蛋白的保守結構域，發(fā)現TaPDF32含有植物防御素特有的γ-硫堇蛋白結構域，屬于γ-硫堇超蛋白家族；TaPDF33和TaPDF34具有Knot1結構域，屬于Knot1超蛋白家族（圖2），兩者均是植物防御素的典型結構域，因此這三個TaPDF屬于典型的植物防御素蛋白。

2.3 成熟TaPDF蛋白的基本特性分析

利用ProtParam軟件對3個去除信號肽的成熟TaPDF蛋白序列進行基本特性分析，結果顯示三者均是含有8個半胱氨酸的陽離子肽，分別由49、49個和47個氨基酸組成，分子量均約為5.5 kD，等電點分別為8.92、8.95和9.37，都是堿性、親水的不穩(wěn)定蛋白。

2.4 TaPDF蛋白的三級結構預測

利用軟件SWISS-MODEL對3個小麥防御素進行蛋白三級結構預測，結果顯示，三者均含有植物防御素所特有的1個α-螺旋和3股反向平行的β-折疊片層結構，與其它物種防御素蛋白的三級結構相似。

2.5 TaPDF蛋白序列比對

利用ESPript軟件對本研究獲得的3個小麥防御素蛋白序列與GenBank中本實驗室提交的31條小麥防御素序列（登錄號：AIA66986.1～AIA67016.1）和另外2條小麥防御素序列（登錄號：BAC10287.1和AGX26528.1）進行序列比對。結果如圖3所示，小麥防御素家族的蛋白序列差異很大，僅信號肽序列的亮氨酸、γ-硫堇蛋白結構域的8個半胱氨酸和1個甘氨酸是完全保守的，其他氨基酸均存在一定的差異。8個半胱氨酸形成的二硫鍵以Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7的方式連接，穩(wěn)定其三級結構。

2.6 系統(tǒng)進化樹分析

將3個TaPDF分別在NCBI上進行BLASTP，檢索到序列相似性較高的植物防御素進行系統(tǒng)進化樹分析。利用MEGA5.0軟件鄰近法構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。本研究獲得的三個TaPDF分別位于進化樹的不同分支上，且與大部分的小麥防御素不在同一支上，僅TaPDF33與另一個小麥防御素及粟米等的防御素聚為一支；而TaPDF32和玉米、粟米等的防御素聚為一支；TaPDF34則與豆科和茄科等的防御素聚成一支。說明TaPDF32～34與已經提交的小麥防御素序列具有較低的相似性，為小麥防御素家族的新成員。

2.7 TaPDF基因的組織特異性表達分析

為研究三個TaPDF基因在小麥不同器官中的表達差異，以濟麥22幼嫩葉片、種子和根的cDNA為模板，以小麥β-Actin為內參基因進行熒光定量RT-PCR分析。結果表明，內參基因β-Actin和TaPDF 基因引物的擴增效率在95.0%～105.0%之間，符合qRT-PCR對擴增效率要求；熒光定量的熔解曲線峰單一，判斷無雜帶。由圖5可知，TaPDF32和TaPDF33在葉中的表達量最高，種子次之，根最少，但種子和根中差異不明顯；TaPDF34在葉、種子和根中的表達量基本相同。

3 討論與結論

第一個植物防御素基因是1990年從小麥[38]和大麥[39]的胚乳中分離出來的，最初被歸類為γ-硫堇家族，后來隨著新的植物γ-硫堇類似蛋白的鑒定，發(fā)現了γ-硫堇與傳統(tǒng)硫堇蛋白之間在結構上存在差異[26，40]，又因為其與哺乳動物和昆蟲的防御素蛋白結構與功能類似，所以將其重新命名為“植物防御素”[26]。2005年，Egorov等利用三步高效液相層析法在六倍體小麥 （T. kiharae） 種子中發(fā)現了24個新的小麥抗菌肽，其中11個屬于植物防御素，并根據N端序列的同源性分成三個亞組，6個Tk-AMP-D肽屬于第一組（D組），Tk-AMP-γ1、Tk-AMP-γ2和Tk-AMP-γ3屬于第二組，Tk-AMP-ω2和Tk-AMP-ω3屬于第三組[41]。2007年，Odintsova等[42]通過組合色譜的方法又在T. kiharae種子中發(fā)現了兩個屬于D組的防御素，因與D1和D6共洗脫下來，將其分別命名為D1.1和D1.6，兩次試驗共鑒定出8個D組防御素基因。同時，他們發(fā)現普通小麥也含有全部的D組防御素基因。氨基酸序列比較分析發(fā)現，D組防御素具有很高的序列同源性（尤其是N端），但是C端保守結構域的Cys6和Cys7之間的部分氨基酸的突變和插入缺失引起了氨基酸序列及長度的多態(tài)性。本試驗通過對獲得的3個TaPDF蛋白與NCBI數據庫中已知的33條TaPDF序列比對發(fā)現，在保守結構域的Cys6和Cys7之間也存在氨基酸的插入缺失現象，其中3條TaPDF在保守結構域的Cys1與Cys2以及Cys4與Cys5之間也出現個別氨基酸的插入。

基因的多樣性可以由古老基因的點突變和插入缺失引起[43]，Wu等對幾種禾本科植物的防御素類似基因的進化進行了分析，結果發(fā)現，玉米、水稻、高粱和二穗短柄草中片段重復和串聯重復推動了防御素類似基因進化過程，然而，4個物種的7個防御素類似基因在進化過程中是高度保守的[44]。TaPDF在進化過程中可能也會發(fā)生基因重排、串聯重復、插入和缺失等情況從而導致TaPDF多樣性[41，42]。本試驗得到的三個TaPDF蛋白與已知的TaPDF序列差異較大，僅信號肽序列的亮氨酸、γ-硫堇蛋白結構域的8個半胱氨酸和1個甘氨酸是完全保守的。對小麥及其他物種的防御素蛋白構建進化樹，發(fā)現部分TaPDF聚為一支，而TaPDF32～34則位于另外的三個不同分支上，表明其與其它TaPDF具有不同之處。

植物防御素主要在種子、花朵、果實、葉片等器官中表達，而這些都是易受病原菌感染而又非常重要的器官。綠豆VrCRP、甜椒PDF和蘿卜Rs-AFP1和Rs-AFP2主要在果實和種子中表達[23， 25， 26]，花煙草NaD1、矮牽?；≒hD1和甘藍tags118則主要在花中表達[14，24]。通過熒光定量RT-PCR對TaPDF32～34進行組織特異性分析，發(fā)現TaPDF32和TaPDF33均在葉片中表達量高，在種子和根中表達量比較低；而TaPDF34在葉片、種子和根中的表達量基本一致。

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