代軍

摘要：針對大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，以pGM-T、pMD-18T為載體，在傳統(tǒng)CaCl2方法的基礎(chǔ)上，對制備及轉(zhuǎn)化條件進行了改進和優(yōu)化，結(jié)果表明，42 ℃熱激的最佳時間為100 s，最適冷卻時間為6～8 min。本研究將常規(guī)的50 mL離心管改成了1.5 mL EP管，有效降低了分裝過程中可能產(chǎn)生的污染風險，簡化了試驗程序，提高了轉(zhuǎn)化效率。

關(guān)鍵詞：基因克隆;大腸桿菌;感受態(tài)細胞;轉(zhuǎn)化條件;改進;氯化鈣法

中圖分類號： Q-331 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0053-02

收稿日期：2014-11-13

基金項目：國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（編號：200904064）。

作者簡介：代 軍（1965—），女，遼寧阜新人，副教授，研究方向為農(nóng)業(yè)生物技術(shù)。E-mail：40048601@qq.com。

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化是分子生物學試驗中一項重要的常規(guī)操作技術(shù)，可用于基因克隆、文庫構(gòu)建等研究[1]。攜帶目的基因的重組質(zhì)粒能否導入受體細胞，進而得以復制、增殖、表達，感受態(tài)細胞質(zhì)量及轉(zhuǎn)化條件是關(guān)鍵因素[2]。目前，商業(yè)公司可為分子生物學試驗提供各種感受態(tài)細胞，但存在價格昂貴、運輸途中容易導致感受態(tài)細胞解凍等問題[3-4]。大部分實驗室仍采用經(jīng)典的氯化鈣法自行制備感受態(tài)細胞[5-6]。大腸桿菌菌株DH5α是實驗室常用的宿主菌，常被用于基因克隆、原核表達研究。氯化鈣轉(zhuǎn)化方法具有操作簡單、重復性好、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點，其原理是Ca2+破壞細胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無機磷酸形成復合物以利于外源DNA滲入[7-8]。不同菌株、不同實驗室環(huán)境對于感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化條件影響不同，因此有必要針對特定菌株對其感受態(tài)細胞制備、轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化。本研究探討該菌株感受態(tài)細胞制備以及轉(zhuǎn)化的最優(yōu)條件，旨在為后續(xù)分子生物學研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株 E.coli DH5α由筆者所在實驗室-70 ℃保存。載體pGM-T、pMD-18T Vector 購于天根生化科技（北京）有限公司、大連寶生物公司。0.1 mol/L CaCl2溶液所用無水CaCl2為國產(chǎn)分析純。氨芐青霉素（ampicillin）購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器

HITACHI SCR20BA 高速冷凍離心機，HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，MP 200A分析天平，Eppendorf移液器，超凈工作臺。

1.3 方法

1.3.1 準備工作 EP管、槍頭、槍頭盒、100 mL三角瓶、培養(yǎng)皿等進行高壓蒸汽滅菌，100 ℃烘干，-20 ℃冷凍備用。

1.3.2 藥品配制 0.1 mol/L CaCl2溶液：取1.11 g無水CaCl2，用容量瓶定容至100 mL，分裝置于50 mL三角瓶中，高壓蒸汽滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?00 mg/mL氨芐青霉素（Amp）：取 1 g Amp溶于100 mL無菌水中，分裝至2 mL EP管中，濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉14.0 g，溶于950 mL無菌水中，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，定容至1 L，高壓蒸汽滅菌，分裝至培養(yǎng)皿。

1.3.3 菌種活化 將DH5α菌種在 LB 固體培養(yǎng)基平板上交錯劃線，37 ℃ 過夜培養(yǎng)，獲得良好單斑。取無菌試管加入2 mL LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，挑取良好單斑接種于試管中，37 ℃ 搖床培養(yǎng)過夜。按1 ∶ 100的比例，取 0.5 mL 菌液轉(zhuǎn)接至含有 50 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37 ℃ 搖床培養(yǎng) 2～3 h，直至 D600 nm 值達 0.4左右[9]。

1.3.4 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備 將菌液分裝至預冷無菌的1.5 mL EP管中，于冰上放置10 min，4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min。將離心管倒置以倒盡上清液，用移液槍將倒不盡的上清液吸出，加入1 mL 0.1 mol/L冰冷CaCl2 溶液，立即在漩渦混合器上混勻，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，倒置1 min，加入1 mL 01 mol/L 冰冷CaCl2 溶液，移液槍輕輕吹打垂懸細胞，冰上放置30 min。4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，棄上清液，倒置 1 min，每管中加入60 μL冰冷0.1 mol/L CaCl2 垂懸細胞，冰上放置 2 h，即可用于轉(zhuǎn)化;也可加入體積分數(shù)為40%的甘油，-70 ℃超低溫保存?zhèn)溆肹10]。

1.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 將5 μL質(zhì)粒DNA直接加入100 mL感受態(tài)細胞中，手指輕彈管底部混勻，冰浴30 min。42 ℃水浴熱激，設(shè)置20 、30、40、60 、80 、90 、100 、120 s 8個時間梯度，設(shè)置2、4、6 、8 min 4個冰浴冷卻時間。加入900 μL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)1.0～1.5 h。取上述轉(zhuǎn)化混合液100 μL，滴到固體LB平板培養(yǎng)皿（含抗生素100 μg/mL Amp）中，用玻璃涂布棒涂布均勻。正面向上放置30～60 min，待表面菌液完全被培養(yǎng)基吸收，倒置培養(yǎng)皿，37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱激時間對轉(zhuǎn)化效率的影響

菌種活化時，每隔30 min測1次D600 nm值（表1）。

表1 大腸桿菌DH5α活化后的D600 nm值