翟曉虎+賀衛(wèi)華+沈曉鵬+陳世杰

摘要：探索優(yōu)化并構建S100A16原核表達載體、制備S100A16蛋白多克隆抗體的條件。試驗方法為，將RT-PCR擴增得到的小鼠肝臟組織的S100A16基因克隆片段連接到帶有His標簽的原核表達載體pET-28a多克隆位點，并轉化大腸桿菌BL21（DE3），用不同溫度、不同濃度IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導融合蛋白表達，通過親和層析柱純化獲得純化的蛋白質。經免疫動物得到His-S100A16抗血清，通過免疫親和層析獲得了具有高度特異性抗體，通過Western Blot和Elisa檢測抗體的特異性和效價，結果表明，在溫度25 ℃、IPTG濃度為0.2 mmol/L的條件下，可溶性蛋白的表達效果較好。

關鍵詞：S100A16;Western Blot;融合蛋白表達;ELISA;小鼠

中圖分類號： Q785 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0039-02

收稿日期：2014-04-01

基金項目：江蘇省泰州市農業(yè)項目（編號：TN2013012）。

作者簡介：翟曉虎（1981—），男，山西渾源人，碩士，講師，主要從事小動物疾病方面的研究。Tel：（0523）86651732;E-mail：zhaixiaohu010@163.com。

S100A16基因是在應用全基因組微陣列芯片技術篩查代謝性疾病相關基因的研究中新獲得的差異表達基因，是鈣調蛋白S100家族的新成員，除了具有S100家族的基本結構特征，還存在更復雜的調節(jié)機制。S100家族在細胞的增生、分化、遷移與凋亡，神經軸突的生長與認知形成及腫瘤發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用[1]。關于其新成員S100A16基因與疾病發(fā)展的研究尚淺，目前尚無明確結論，經有關科研機構研究，初步闡明S100A16基因在代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究擬探討并優(yōu)化S100A16多克隆抗體的制備條件與方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

新西蘭白兔，購自江蘇省農業(yè)科學院，成年公兔體質量4～5 kg，母兔體質量4.5～55 kg。

1.2 試驗儀器

主要試驗儀器有：Eppendrof 5810冷凍離心機，凝膠成像儀，BioTek酶標儀，BioTek洗板機，普通PCR儀，冷凍離心機，Thermo電動移液器，Nuaire生物安全柜，三洋高壓滅菌鍋，Revco超低溫冰箱，Milipore純水儀，制冰機，振蕩器，分光光度計，電泳設備，國產大龍移液器。

1.3 試驗試劑

PBS（磷酸鹽緩沖液，含蛋白酶抑制劑、1%TritionX-100、5%甘油）、PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）、1 L TBS（Tris-HCl緩沖鹽溶液）、TBST 洗脫液（1 L TBS溶液中加0.5 mL Tween20）、LB培養(yǎng)基、SDS（十二烷基磺酸鈉）電泳液、轉膜液、封閉液、10% SDS、10% APS、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）、UREA（尿素）、PMSF（苯甲基磺酰氟）、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、AMP（氨芐西林）、卡那霉素（Kana）、曝光顯色劑、025%考馬斯亮藍G250、脫色液等。

1.4 試驗方法

1.4.1 接種活化 接種活化方法按常規(guī)方法進行。

1.4.2 傳代培養(yǎng) 于滅菌三角搖瓶內加50 mL LB（含50 μg/mL Kana），接種1 mL已轉化His-S100A16的大腸桿菌BL21（DE3）過夜活化，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5～6 h。

1.4.3 擴大培養(yǎng) 在1 L滅菌三角搖瓶內加450 mL LB（含50 μg/mL Kana），接種50 mL傳代His-S100A16轉化的大腸桿菌BL21（DE3），于37 ℃、220 r/min條件培養(yǎng)1～2 h。

1.4.4 誘導培養(yǎng) 待擴大培養(yǎng)的His-S100A16的D600 nm約為0.6時，取500 μL菌液留樣，再加誘導劑IPTG，150 r/min 下過夜誘導。為了使蛋白盡量以可溶性形式表達，試驗設5個溫度條件，A、B、C、D、E組分別為16、20、25、30、37 ℃，每個組的IPTG濃度均設4個梯度：0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L。

1.4.5 菌體收集處理 （1）菌體收集：先取500 μL菌液，于12 000 r/min離心2 min，棄上清，加100 μL 1×loading buffer，用漩渦器將EP管底部菌體打散，在干式恒溫器中96 ℃變性10 min;然后于12 000 r/min離心2 min，轉移上清到新的EP管中，作標記后-20 ℃保存;取出后于4 ℃、6 000 r/min離心15 min，棄上清。（2）破碎（冰上操作）：加30 mL PBS混勻菌體沉淀[2]。（3）超聲：在冰水混合物中進行，超聲條件：65%Amp， 超聲3 s，間歇5 s，累計10 min，超聲后離心：4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，0.22 μm濾器過濾。（4） SDS電泳檢測。

1.4.6 過柱純化和超濾 （1）His-S100A16蛋白純化（冰上操作）。（2）稀HCl清洗系統20 min，75%乙醇清洗系統 20 min，水洗系統20 min，綁定5 min，調節(jié)流速為1 mL/min，連接His-Trap柱，綁定15 min，平衡柱，上樣;過濾，綁定洗雜蛋白20 min，洗脫，接8管，每管1 mL，綁定，加20%乙醇[3]。（3）超濾S100A16蛋白：根據蛋白電泳的結果，混合純化的S100A16，用PBS置換buffer（向加入樣品的超濾管中加入PBS，幾乎加滿后離心，保留濾液，洗2次;用考馬斯亮藍G250測蛋白濃度，如果還有蛋白則收集后再次超濾，超濾至考馬斯亮藍G250測蛋白濃度顏色較深為止），收集S100A16蛋白，SDS電泳檢測S100A16。