孫碩　呂世明　譚艾娟　華夏　李博巖　焦亞琴

摘 要：通過測定野生型大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物敏感的、耐藥的以及從耐藥誘導恢復敏感的3種菌株的生長曲線，探討適應度代價對細菌耐藥性變化的影響。結果表明：對氟喹諾酮類藥物耐藥的大腸桿菌C02的生長速率遠低于敏感菌株C01和恢復敏感性后菌株C03； 而敏感菌株C01和敏感性恢復菌株C03的細菌生長曲線相近，說明在無藥物選擇壓力環(huán)境中，適應度代價高的耐藥菌生存競爭力低于適應度代價低的敏感菌，敏感菌逐漸取代耐藥菌，使菌群對藥物的敏感性得以恢復。

關鍵詞：大腸桿菌；氟喹諾酮類藥物；適合度代價；生長曲線；敏感性恢復

中圖分類號：R378.2+1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.008

Abstract： To discuss the effect of the fitness cost on drug-resistanc reversal of Escherichia coli， the growth curves of three strains E.coli， which E. coli C01 was sensitivity to fluoroquinolones， E. coli C02 was resistance to fluoroquinolones and E. coli C03 was restored sensitivity to fluoroquinolones， were determined. The result showed that the growth velocity of E. coli C02 resistented to fluoroquinolones was far lower than E. coli C01 or E. coli C03， and the growth velocities of E. coli C01 or E. coli C03 were quit similar. It demonstated that the survival competitiveness of drug-resistant bacteria possessed the high fitness cost was lower than sensitive one armied low fitness cost in the environment of no drug selection pressure. The drug-resistant bacteria was gradually replaced by ensitive bacteria and the drug sensitivity of microbiome was restored.

Key words： Escherichia coli； fluoroquinolones； fitness cost； growth curve； sestore sensitivity

細菌耐藥性是現(xiàn)代醫(yī)學所面臨的一大重要難題，近幾年的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)細菌的耐藥率呈現(xiàn)普遍上升趨勢[1-2]。在養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥物的不規(guī)范用藥，導致動物源細菌耐藥水平不斷升高，對養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展構成嚴重威脅，并增加了動物性食品的不安全性[3]，因此，探索降低或消除細菌耐藥性已經(jīng)成為當前研究的熱點。研究表明，高度耐藥的沙門氏菌在沒有藥物選擇壓力的環(huán)境中其適合度代價將升高[4]，其生長競爭力低于敏感菌，使得敏感菌成為優(yōu)勢菌群，最終取代耐藥菌而恢復對藥物的敏感性。故養(yǎng)殖場可通過停止使用某種抗菌藥物來恢復細菌對該藥物的敏感性[5]。本研究通過測定對耐氟喹諾酮類藥物不同耐藥狀態(tài)大腸桿菌的生長曲線，考察對氟喹諾酮類藥物耐藥大腸桿菌生存適合度代價在細菌耐藥性恢復上的作用，為養(yǎng)殖場制定合理的輪換用藥方案，降低細菌耐藥性的危害提供支持。

1 材料和方法

1.1 菌株、藥物和試劑

藥物：環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星，均購自大連美侖生物技術有限公司。試劑：LB培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂、MHB瓊脂均購于上海博微生物科技有限公司。

菌株：大腸桿菌質控菌株ATCC 25922，購自中國獸藥監(jiān)察所；野生型豬源大腸桿菌由貴州大學動物科學學院藥理實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 大腸桿菌對五種氟喹諾酮類藥物MIC的測定 參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）抗菌藥物敏感性實驗操作標準，采用微量肉湯稀釋法，測定豬源大腸桿菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星5種氟喹諾酮類藥物的MIC。

1.2.2 耐藥大腸桿菌C02誘導 通過藥敏試驗篩選得到野生型敏感大腸桿菌C01，將C01在含有1/2MIC喹諾酮類藥物的LB肉湯培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)誘導，使其對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星均表現(xiàn)為中度耐藥（C02）。

1.2.3 耐藥菌敏感性恢復誘導 將耐藥菌C02與敏感菌C01按95%：5%的比例混合后取1 mL加到4 mL的LB肉湯中，置于37 °C，傳代230代，測定MIC值。

1.2.4 細菌生長曲線測定 參照任慧英方法改進，在600 nm的光密度下測量LB肉湯培養(yǎng)基中大腸桿菌的生長曲線。將敏感的C01菌株和誘導耐藥的C02、C03菌株分別置于LB肉湯培養(yǎng)基中，37 °C下分別培養(yǎng)0，0.5，1，1.5，2，2.5，3， 3.5，4，5，6，7，8，9，12 h，然后分別測定它們的OD值，并繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗結果

通過表1可以看出，野生型敏感大腸桿菌C01對5種氟喹諾酮類藥物均敏感，而C01經(jīng)短時間藥物誘導后得到的大腸桿菌C02對5種藥物呈現(xiàn)中度耐藥，耐藥的C02在無藥環(huán)境和有敏感菌存在條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)得到CO3，其對5種藥物的MIC值恢復至敏感性。

2.2 細菌生長曲線測定

從C01、C02、C03的生長曲線（圖1）可以看出，對藥物敏感的C01和C03生長趨勢和速率十分相近，而對藥物耐藥的C02的增長率遠遠低于C01和C03，證明大腸桿菌的耐藥性可提高細菌的適合度代價，可降低細菌的生長率。

3 討 論

細菌的適合度代價是指在沒有選擇壓力條件下，如果特定基因型個體的適合度低于種群平均的適合度，即可以認為該基因型存在適合度代價。在藥物選擇壓力下，個別細菌可通過有意義的基因突變或接受其他耐藥菌的耐藥基因而獲得對藥物的耐藥性，提高了其在有藥物環(huán)境中的生存適應度，成為優(yōu)勢菌，并逐漸取代敏感菌而表現(xiàn)對藥物耐藥 [6-8]。但在沒有藥物選擇壓力的環(huán)境中，耐藥菌由于生存適合度代價的升高，其適應性、毒力及質粒轉移率均較敏感株明顯下降，敏感株處于主導優(yōu)勢，能抑制耐藥菌的生長，甚至在一定時間內將耐藥菌清除，使細菌群體對藥物的敏感性得以恢復[9]。

研究結果表明，耐藥菌在無藥環(huán)境中的生長速率大大低于敏感菌，說明獲得高度耐藥細菌在沒有抗菌藥物的選擇壓力時生存適合度高于敏感菌；將敏感菌參入耐藥菌中后置于無藥環(huán)境中傳代230代，可使細菌對藥物的敏感性得以恢復，試驗結果證實了細菌生存適應度代價的高低對細菌種群進化方向的影響，同時，在實驗室條件下證實了養(yǎng)殖生產(chǎn)中和臨床治療中可采用輪換用藥來對抗細菌耐藥性危害的機制。

因此，規(guī)范用藥、建立合理的輪換用藥機制，對養(yǎng)殖業(yè)中細菌耐藥率和耐藥水平的控制有很大意義。

參考文獻：

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