李貴蕭　朱宗濤　康燕青等

摘要：將不同來源的60株菌株進行致病性試驗及血清補體抗性檢測，探討補體抗性與雞大腸埃希菌致病力的相互關(guān)系。結(jié)果表明，大腸桿菌在血清中的存活能力與其致病力間相關(guān)系數(shù)為0.259，P值=0.046<0.05，即大腸桿菌的補體抗性與其致病力顯著相關(guān)。

關(guān)鍵詞：雞；大腸桿菌；致病性；血清補體；抗性

中圖分類號： S858.31文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0301-02

收稿日期：2014-11-18

基金項目：國家自然科學基金青年項目（編號：31302128）。

作者簡介：李貴蕭（1991—），女，山東德州人，主要從事食品營養(yǎng)與衛(wèi)生方面的研究。

通信作者：樊琛。E-mail：fanchen7810@126.com。 雞大腸桿菌病是由大腸桿菌中的某些致病性菌株引起的雞感染性疾病的總稱，是養(yǎng)雞生產(chǎn)中常見的一種傳染病，該病可增加其他病原體感染機會，對養(yǎng)殖及食品安全有較大影響[1-3]。為了解典型大腸桿菌的特性，了解大腸桿菌血清抗性與致病性的關(guān)系，對60株菌進行血清補體抗性試驗，并結(jié)合雞胚致死率探索雞大腸桿菌的致病力及其補體抗性的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源BL21、TG1為感受態(tài)細菌；SL1、SL3、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD10、SD11、SD12、SD13、SD14、SD15、SD17、SD18、SD19、SD20、SD21、SD22、SD23、SD24、SD25、SD26、SD27、SD28、SD29、SD30、SD31、SD32、SD33、SD34、SD35，共34株，采自于山東地區(qū)健康雞糞便，聊城大學食品安全教研室保存；cvcc1551、cvcc1553、cvcc1562、cvcc1568、O1、O78，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；O2、新大、田大、北京1、北京3、貴州分別為來自北京市、貴州省、黑龍江省3個發(fā)病雞場分離的強毒株，由東北農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)教研室保存；E1、E4、E5、E7、E8、E9、E10、E11、E14、E18、E21、E27從外觀健康的不同雛雞糞便中分離鑒定獲得，由東北農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)教研室保存。

1.1.2試劑伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、生化試驗鑒定管、各種生物化學試劑，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3試驗動物11日齡雞胚購于山東省聊城市陽谷縣。

1.2方法

1.2.1細菌的活化挑取活化的菌種接種于伊紅美藍培養(yǎng)基于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑取紫黑色帶綠色金屬光澤的菌落，連續(xù)2次接種于麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h[4-6]。選純紅色菌落，以無菌操作進行抹片、革蘭氏染色鏡檢，進行IMViC生化鑒定試驗，確定后于LB普通營養(yǎng)肉湯進行純擴增培養(yǎng)24 h[7-11]，記錄試驗結(jié)果，純培養(yǎng)物置于 4 ℃ 冰箱備用。

1.2.2細菌的致病性試驗用接種環(huán)挑取平板上的單菌落，在普通營養(yǎng)肉湯中37 ℃搖床培養(yǎng)10～12 h。取1 mL的菌液4 000 r/min離心2 min，棄去上清液，再用生理鹽水洗2次，倍比稀釋。取0.1 mL稀釋液經(jīng)尿囊腔注射11日齡SPF雞胚，100～300 CFU/只，每組10只，同時取0.1 mL稀釋液涂板，做細菌計數(shù)。對照組注射生理鹽水，共注射10只。于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，每日檢蛋，記錄每日死亡數(shù)，至第4天，記錄胚胎的死亡率。

1.2.3血清制備無菌操作取雞血于已滅菌的離心管中，37 ℃ 放置1～2 h，再于4 ℃靜置3～4 h，3 000 r/min離心 20 min，取上清液于-20 ℃保存[8-9]。

1.2.4菌株血清抗性檢測用接種環(huán)挑取平板上的單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期。取500 μL菌液 4 000 r/min 離心2 min，棄掉上清液，用0.06 mol/L的NaCl洗1次，重懸于0.9%的生理鹽水，倍比稀釋2次。再將 0.1 mL 細菌懸液與0.4 mL血清相混合，37 ℃溫育2 h，分別于0、2 h取樣平板計數(shù)。平行2次取平均值，計算培養(yǎng)0、2 h活菌數(shù)的對數(shù)差值，通過統(tǒng)計學分析，判定菌株的血清抗性強弱[5-6]。

2結(jié)果與分析

2.1細菌的活化

試驗中58株自然菌在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；麥康凱瓊脂上為表面光滑濕潤中央輕微隆起、邊緣整齊菌落；在營養(yǎng)瓊脂上形成圓形微凸起、表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明灰白色菌落；肉湯中培養(yǎng)呈現(xiàn)混濁，輕搖呈絮狀物存在，部分菌株可在肉湯表面形成菌環(huán)；M-R試驗、吲哚試驗呈陽性，枸櫞酸鹽、V-P試驗呈陰性，符合大腸桿菌的特征。

2.2菌株血清抗性檢測結(jié)果

經(jīng)SPSS軟件分析60株菌培養(yǎng)0、2 h活菌數(shù)的對數(shù)差值，得補體抗性在90%的置信區(qū)間為[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限（-1.538 9）的即具有血清抗性的共22株，介于上限（-1.538 9）與下限（-2.120 5）之間的即血清抗性處于中間態(tài)的共12株，小于下限的即血清敏感菌株共26株（表1）。

2.3菌株致病性試驗結(jié)果

經(jīng)SPSS軟件分析，60株菌的致死率在90%的置信區(qū)間[0.095 5，0.194 5]，大于上限（0.194 5）的共32株菌，即具有高致病性的菌株共32株，在上限（0.194 5）和下限（0.095 5）之間的共13株，即中等致病性菌株的共10株，下限（0.095 5）以下的共有15株，即無致病性/低致病性的菌株共15株（表1）。

由表1可見，60株菌的補體抗性在90%的置信區(qū)間為[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限的共22株菌，即具有血清抗性的共22株，其Δlg的平均值為-0.319 0，相應菌株的致死率的平均值為34%。在上限（-1.538 9）和下限（-2.120 5）之間的共12株，即血清抗性處于中間態(tài)的共12株，其Δlg的平均值為-1.844 7，相應菌株的致死率的平均值為23%。在下限（-2.120 5）的共有26株，即血清敏感的共26株，其Δlg的平均值為-2.870 2，相應菌株的致死率的平均值為18%。結(jié)果表明，血清抗性菌株的平均致死率高于血清敏感性菌株的平均致死率。

經(jīng)SPSS軟件分析可知，60株大腸桿菌在血清中的存活能力與其致病力間相關(guān)系數(shù)為0.259，P=0.046<0.05，即大腸桿菌的補體抗性與其致病力顯著相關(guān)。

3討論

試驗從健康雞糞便中分離到60株大腸桿菌，對其中58株自然菌進行分離培養(yǎng)、生化鑒定，均符合大腸桿菌的結(jié)構(gòu)特征，確定58株菌株均為大腸桿菌。致病力試驗目前通常采用雛雞致死試驗及雞胚致死試驗，如常新耀等在雞大腸桿菌的生化特性、致病性及藥敏試驗研究試驗中，對試驗組10日齡蛋雞頸部皮下接種菌株培養(yǎng)物，每羽0.1 mL，對照組腹腔接種相同劑量的滅菌生理鹽水[11]；賴平安等在雞大腸桿菌致病力與某些生物特性的相關(guān)性探討試驗中，每一菌株分別 0.5 mL/羽于頸部皮下接種5羽1日齡雛雞，對照組于頸部皮下接種同等量的滅菌生理鹽水[12]；劉靜等在中國部分地區(qū)禽源性大腸桿菌分離株的致病性試驗中，取0.1 mL的LB培養(yǎng)物于靜行氣管內(nèi)注射1日齡羅曼商品代蛋公雞，對照組注射同劑量肉湯[13]，本試驗采用尿囊腔注射11日齡SPF雞胚，對照組注射同劑量生理鹽水，結(jié)果顯示，此方法可分析大腸桿菌致病力。對60株菌株進行致病性試驗及血清抗性試驗，結(jié)果表明，大腸桿菌在血清中的存活能力與其致病力間相關(guān)系數(shù)為0.259，P=0.046<0.05，即大腸桿菌的補體抗性與其致病力顯著相關(guān)。王晶鈺等在雞源大腸桿菌某些生物學持性與致病力相關(guān)性研究中表明大腸桿菌的致病力與血清型和溶血性無關(guān)，而與剛果紅表型、鹽凝集性和補體抗性呈明顯正相關(guān)[7]。陳祥等在禽源大腸桿菌的生物表型特性試驗中，比較243個禽分離株的血清耐受和致病性的關(guān)系中，結(jié)果說明血清耐受與致病性呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，血清耐受與致病力呈良好的相關(guān)性[8]。牛明福等在多殺性巴氏桿菌的血清抗性及毒力比較研究中提到一些巴氏桿菌菌株和其他革蘭氏陰性菌血清抵抗力與對動物的毒力有關(guān)[9]。本試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌的補體抗性與其致病力具有相關(guān)性。

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