晏國(guó)洪　姜山

摘要：研究了CaCl2，溶液處理方法、長(zhǎng)期保存的原始菌種活化次數(shù)、離心條件對(duì)感受態(tài)細(xì)胞最終轉(zhuǎn)化效率的影響，并分析其最佳轉(zhuǎn)化效率參數(shù)、優(yōu)化感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：使用過濾處理的GaCl2比滅菌處理的CaCl2制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高。在其他條件相同的情況下，長(zhǎng)期保存的大腸桿菌菌種活化3次以上的轉(zhuǎn)化率最高；制備感受態(tài)細(xì)胞第1次離心在4℃、4 000g條件下離心15min，第2次離心時(shí)在4℃、4000g條件下離心5min得到的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；感受態(tài)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化率；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q813.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）05-0046-03

DH5α是一種常用于質(zhì)?？寺〉木N。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室頻繁使用的一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α在使用含NPTⅡ質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可用卡那霉素鑒別重組菌株。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌技術(shù)的關(guān)鍵是通過物理或者化學(xué)的方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞成為敏感的感受態(tài)細(xì)胞，這種細(xì)胞易接受外源DNA，但由于轉(zhuǎn)化是一個(gè)很復(fù)雜的過程，具體的作用機(jī)理尚不明確。一些優(yōu)良的大腸桿菌菌種價(jià)格較貴或獲得途徑較難，而實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌菌種一般時(shí)間較長(zhǎng)（約5～10年），導(dǎo)致菌種部分死亡和活力降低，在實(shí)際操作中制得的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率常常不能滿足試驗(yàn)的要求。

對(duì)于大腸桿菌而言，外源DNA導(dǎo)入主要有電穿孔轉(zhuǎn)化法、MgCl2-DMSO法、Inoue法、CaCl2法等多種。電穿孔轉(zhuǎn)化法需要特殊的儀器設(shè)備，MgCl：-DMSO法和Inoue法操作比較復(fù)雜。而CaCl2轉(zhuǎn)化法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、方便，而且成本非常低廉，已成為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行基因克隆操作常用方法。CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵因素有CaCl2溶液的質(zhì)量、大腸桿菌DH50z生理狀況、制備過程中的離心條件。本試驗(yàn)用CaCl2法對(duì)保存了5.5年的菌種按以上3個(gè)關(guān)鍵因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞的制備條件。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒大腸桿菌DIlSa由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，pRll01-ON質(zhì)粒購(gòu)置于TaKaRa公司（圖1）。

1.1.2試劑LB培養(yǎng)基，卡那霉素素溶液，CaCl2溶液，均按文獻(xiàn)[10]的要求配制。

1.1.3儀器凝皎成像系統(tǒng)、電泳儀、超凈工作臺(tái)、冷凍離心機(jī)、搖床、紫外分光光度計(jì)。

1.2

方法

1.2.1提取pRll01-ON質(zhì)粒按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作。

1.2.2活化菌種 （1）從一80 qC冰箱中取出長(zhǎng)期保存的大腸桿菌，用無菌牙簽刮取固體（仔細(xì)操作不要讓其融化），然后在LB平板上劃線。

（2）取5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基加入支無菌試管中。

（3）用接種環(huán)挑1個(gè)單菌落，浸沒于培養(yǎng)液中并輕輕搖動(dòng)接種環(huán)，使待接種的細(xì)菌分散于培養(yǎng)液中。

（4）蓋好試管，在搖床上以60r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和（新鮮培養(yǎng)至飽和期的培養(yǎng)細(xì)菌濃度約為10億～20億個(gè)/mL），一般須過夜培養(yǎng)。

（5）取出（4）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮lJH培養(yǎng)基試管中，在搖床上以220 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測(cè)定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細(xì)胞。（活化1次）

（6）將活化過1次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（7）取出（6）中O.2 mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220 r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20MIN取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測(cè)定D600NM值，另一支制備感受態(tài)細(xì)胞。（活化2次）

（8）將活化過2次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LH液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/rain、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（9）取出（8）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4 qC冰箱統(tǒng)一測(cè)定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細(xì)胞。（活化3次）

（10）將活化過3次的大腸桿菌取100uL加入5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基在搖床上于60r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)至飽和。

（11）取出（10）中0.2mL培養(yǎng)物到含有10mL新鮮LB培養(yǎng)基試管中，在搖床上于220r/min、37℃條件下振蕩培養(yǎng)，每隔20min取出2支試管，一支放入4℃冰箱統(tǒng)一測(cè)定D600nm值，另一支制備感受態(tài)細(xì)胞。（活化4次）

1.2.3制備感受態(tài)細(xì)胞 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。搖好的菌液試管冰浴30min，分裝成2mL，在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加800uL冰預(yù)冷的0.1mo]/L CaCl：重懸浮，分別使用O.22汕m的濾菌器和高溫滅菌。再在4℃、4000g條件下離心8min，棄上清，加100uL冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸浮，4℃保存12～24h。

1.2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 把100uL的感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上，加入轉(zhuǎn)化的10ng DNA，于冰中放置30min。42℃熱激90s，再在冰中放置2～3min，加入37℃條件下預(yù)熱好900uL的LB培養(yǎng)基，37℃條件下振蕩1h。取10uL菌液稀釋涂布平板（平板預(yù)熱），37℃條件下正向培養(yǎng)1h，再過夜培養(yǎng)。

1.2.5計(jì)算轉(zhuǎn)化子總數(shù)=該皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/稀釋倍數(shù)）；

轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（ug）。2結(jié)果與分析