【摘要】目的 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法分析清肺化痰湯應用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中藥物的成分、作用靶點、信號通路及靶蛋白等作用機制。方法 以口服生物利用度≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，篩選出清肺化痰湯的活性成分及相應的靶點與COPD靶點相交情況，探討清肺化痰湯治療COPD的作用機制、藥理學依據(jù)等情況。結(jié)果 在中草藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）中檢索，以每種活性成分的口服生物利用度從高到低排序，篩選出前20種活性成分。通過TCMSP獲得清肺化痰湯中的活性成分靶點，獲取其基因符號（GeneSymbol）。上傳至韋恩（VENN）圖在線網(wǎng)站后，獲得交集靶點信息約222個。度值（Degree）排名前5的蛋白分別為蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白蛋白（ALB）、白細胞介素-6（IL-6）、1 號染色體的基因（JUN）及血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）。在生物學過程中關鍵靶點的基因參與了細胞對化學應激反應及類固醇激素反應；細胞主要成分包括薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細胞膜穴樣內(nèi)陷及囊泡腔。主要涵蓋脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、晚期糖基化終產(chǎn)物-細胞表面受體-糖基化終產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路等。清肺化痰湯是通過多靶點、多信號通路共同發(fā)揮治療COPD作用，其中轉(zhuǎn)錄因子P65、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、AKT1為主要靶點蛋白。分子對接結(jié)果表明，清肺化痰湯中藥物活性成分與MAPK1、AKT1、血清酶（RELA）、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶（CHUK）、IkB激酶β（IKKβ）靶蛋白的親和力較強。結(jié)論 本研究初步揭示清肺化痰湯通過多成分、多靶點、多通路治療COPD的分子機制，為臨床提供了理論基礎。

【關鍵詞】清肺化痰湯；慢性阻塞性肺疾??；網(wǎng)絡藥理學；信號通路；靶蛋白；分子對接

【中圖分類號】R563.9；R285 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.03.0030.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.03.010

隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國慢性非傳染性疾病（主要包括精神疾病、腦卒中、癌癥及心血管疾病等）患病率不斷上升，損害患者健康，甚至危及生命[1]。隨著人口老齡化及環(huán)境污染情況的日趨加重，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）的發(fā)病率也不斷上升，我國≥20歲人群COPD患病率高達8.6%，已成為威脅國民呼吸系統(tǒng)健康的主要疾病[2]。COPD是以氣流阻塞為特征的肺部氣腫及慢性支氣管炎癥疾病，典型癥狀為咳痰、咳喘及氣短等，且具有反復發(fā)作、難以根治的特點，嚴重影響患者生活?，F(xiàn)代醫(yī)學已明確該病主要因日常生活中的有害氣體及有害顆粒誘發(fā)炎癥反應所致，主要采用藥物保守治療，包括支氣管擴張劑、吸入糖皮質(zhì)激素、鎮(zhèn)咳祛痰劑及抗氧化劑等，雖能達到一定效果，但復發(fā)率較高[3]。清肺化痰湯出自《風勞臌膈》，主要治療火熱乘肺，咽喉干痛，鼻出熱氣，咳喘上壅，甚則風嘶咯血，痰咳而難出，痰色黃且濃等癥狀。該方具有清肺、止咳及化痰等功效；有研究指出，該方能緩解COPD的癥狀，提高療效[4]，但其有效成分及具體作用機制尚未完全明確。中藥具有“多成分、多靶點、多途徑”整合調(diào)節(jié)作用特點，使其在治療中可以發(fā)揮多種作用，本研究通過篩選清肺化痰湯的活性成分及其相應靶點與COPD靶點的相交情況，探討清肺化痰湯治療COPD的作用機制、藥理學依據(jù)等情況，為清肺化痰湯的進一步應用及研究提供理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 篩選清肺化痰湯中的活性成分 清肺化痰湯中的藥物種類分別為桑白皮、魚腥草、浙貝母、瓜蔞殼、法半夏、黃芩、瓜蔞仁、茯苓、蘇子、甘草及杏仁，使用藥物的中文名在中草藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）進行檢索，以口服生物利用度≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，得到與藥物作用相關的化學成分，再根據(jù)藥代動力學特點，篩選出符合要求的活性成分。同時，對所得到藥物的所有靶點進行復制，整理出對應的文檔，建立靶點文件。

1.2 獲取COPD相關靶點 以“COPD”的英文“chronic obstructive pulmonary diseases”在DAVID在線免費分析軟件中檢索相關靶點并整合，去除重復項后即得到COPD的相關靶點，并整合清肺化痰湯中活性成分的靶點及其在治療COPD中的潛在作用靶點。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建 將上述活性成分及作用靶點傳至STRING在線網(wǎng)站，生成PPI網(wǎng)絡圖后下載并進行優(yōu)化分析。

1.4 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將清肺化痰湯中的活性成分與潛在靶點導入至DAVID在線免費分析軟件中，并選擇性地進行GO通路富集和京都基因與KEGG通路富集分析，以Plt;0.05時為顯著富集，用R語言選擇排序靠前的結(jié)果用條形圖或氣泡圖進行表示。

1.5 分子對接分析 分子對接可以預測小分子（配體）與靶標蛋白之間的結(jié)合作用，結(jié)合能越小則配體與受體的構(gòu)象越穩(wěn)定。幾何匹配的計算采用格點計算、片斷生長等方法，能量計算則使用模擬退火、遺傳算法等方法。并根據(jù)簡化的程度與方式，分為剛性對接、半柔性對接及柔性對接三種方法。選取合適的方法進行分子對接的計算。

2 結(jié)果

2.1 清肺化痰湯中藥物活性成分的篩選結(jié)果 在TCMSP中進行檢索，清肺化痰湯中含有的11味藥物成分，能夠獲得178個活性成分，桑白皮、魚腥草、浙貝母、瓜蔞殼、法半夏、黃芩、瓜蔞仁、茯苓、蘇子、甘草及杏仁分別存在32、7、7、4、13、36、7、15、16、22、19個，剔除46個重復項后剩余132個。以每種活性成分的口服生物利用度由高到低排序，篩選出前20種活性成分，見表1。

2.2 清肺化痰湯治療COPD潛在靶點預測結(jié)果 通過TCMSP獲得清肺化痰湯中的活性成分靶點，刪除重復項后剩余253個，以“chronic obstructive pulmonary diseases”為關鍵詞，檢索數(shù)據(jù)庫，得出COPD的相關靶點，刪除重復項后剩余7 497個。之后依據(jù)其靶點信息注釋所有的藥物和疾病靶點，獲取其基因符號（GeneSymbol）。并將結(jié)果上傳至韋恩（VENN）圖在線網(wǎng)站后，獲得交集靶點信息約222個，得到VENN圖，見圖1。

2.3 PPI的構(gòu)建 將藥物中共同具備的蛋白基因上傳至STRING網(wǎng)站后，分別運行Cytoscape3.7.2軟件和Cytohubba插件，最后自動取得度值（Degree）排名前5的蛋白，分別為蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白蛋白（ALB）、白細胞介素-6（IL-6）、1 號染色體的基因（JUN）及血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）。其中Degree越大，越可能是清肺化痰湯治療COPD的關鍵靶點，見圖2。

2.4 GO富集分析結(jié)果 借助R語言軟件得到GO條目共2 424個（Plt;0.05），其中包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF），分別有2 139個、89個、196個，同時以P值作為參考進行排序，生成條圖，對生物學過程進行分析后發(fā)現(xiàn)，關鍵靶點的基因參與了細胞對化學應激的反應及類固醇激素反應；細胞主要成分包括薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細胞膜穴樣內(nèi)陷及囊泡腔，見圖3。

2.5 KEGG通路富集分析及關系網(wǎng)絡構(gòu)建 使用R語言軟件對清肺化痰湯藥物-COPD共同作用的222個靶點基因進行KEGG通路富集分析篩選后，共有165條通路，并匯集前20條通路制圖，見圖4。主要涵蓋脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路等。

2.6 KEGG通路關系網(wǎng)絡 將清肺化痰湯-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡與PPI相結(jié)合，繪制KEGG通路關系網(wǎng)絡，見圖5。結(jié)果顯示，清肺化痰湯是通過多靶點、多信號通路共同發(fā)揮治療COPD作用，其中轉(zhuǎn)錄因子P65、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、AKT1為主要靶點蛋白。

2.7 分子對接結(jié)果分析 分子對接結(jié)果表明，清肺化痰湯中藥物活性成分與MAPK1、AKT1、血清酶（RELA）、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶（CHUK）、IkB激酶β（IKKβ）5種靶蛋白的親和力較強，見表2。因此，可以認為其構(gòu)象穩(wěn)定并具有結(jié)合活性，印證了該研究的科學性和可靠性。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，依托多個數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建系統(tǒng)網(wǎng)絡并細致分析藥物的相關靶點通路信息，系統(tǒng)地針對清肺化痰湯治療COPD 的相關作用機制進行探討，發(fā)現(xiàn)清肺化痰湯治療 COPD 具有“多成分、多靶點、多通路”的特點[5]。該方劑中的藥物活性成分與MAPK1、AKT1及RELA等多種靶蛋白具有較強的親和性，認為清肺化痰湯的構(gòu)象較為穩(wěn)定[6]。清肺化痰湯的關鍵活性成分與治療COPD的關鍵作用靶點具有較好的結(jié)合活性，印證了該研究的預測科學性和可靠性[7]。

清熱化痰湯主要由白皮、魚腥草、浙貝母、瓜蔞殼、法半夏、黃芩、瓜蔞仁、茯苓、蘇子、甘草及杏仁等藥物組成，白皮、魚腥草清熱解毒，浙貝母、瓜蔞殼及瓜蔞仁具有清熱化痰的功效、法半夏能夠燥濕化痰，黃芩具有瀉火解毒的功效，茯苓具有利水滲濕的功效，蘇子能夠止咳平喘，甘草能夠祛痰止咳，杏仁能夠止咳平喘。諸藥合用，能夠有效緩解COPD患者的癥狀。

本研究結(jié)果顯示，清肺化痰湯可能是通過調(diào)控白細胞介素-17（IL-17）信號通路、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路及輔助性T細胞17（Th17）細胞分化等信號途徑，起到抑制活化的細胞因子、消除炎癥、改善患者癥狀的作用。但上述的內(nèi)容目前臨床尚缺乏系統(tǒng)的文獻參考，存在一定的局限性，今后還需要采取更深入的實驗得到進一步的分析結(jié)果。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法系統(tǒng)分析了清肺化痰湯中含有的主要成分及作用靶點，主要從分子的角度系統(tǒng)論述了該種藥物的復方多成分、多靶點特性對患者機體的調(diào)控能力，對為其后續(xù)的深入的機制研究提供了較為清晰的方向及理論依據(jù)。

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