王建梅 強(qiáng)樹(shù)華 高虹 劉丹丹 霍晶

(臨汾市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,山西 臨汾 041000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)主要特征為滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨質(zhì)疏松和全身性炎癥反應(yīng),具有高致殘率的特點(diǎn),有調(diào)查顯示,其致殘率高達(dá)50%,已經(jīng)成為全球?qū)е聞趧?dòng)能力喪失的第31位疾病,故有“不死的癌癥”之稱(chēng)〔1〕。近年來(lái)研究表明,氧化應(yīng)激在RA的發(fā)生、發(fā)展中具有極其重要的作用,發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量活性氧簇和活性氮簇,從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降,進(jìn)而造成滑膜組織、肺組織等的損傷,加重疾病,因此抗氧化應(yīng)激對(duì)治療RA至關(guān)重要〔2〕。RA的一個(gè)典型病理特征就是骨破壞,而破骨細(xì)胞是其中的關(guān)鍵因素,破骨細(xì)胞主要由滑膜細(xì)胞分化而來(lái),故抑制滑膜細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞對(duì)RA的發(fā)生和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用〔3〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在RA的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞中扮演著關(guān)鍵的角色,MMP-9是其主要成員,可促進(jìn)血管中內(nèi)皮遷移和形成新管腔,在RA血管翳的形成中扮演著重要角色〔4〕。近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明,微小RNA(miRNA)參與了RA的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,是骨損傷疾病最重要和最活躍的調(diào)控因子之一〔5〕。miR-34a-5p是一種可在不同器官發(fā)揮多效性調(diào)節(jié)功能的 miRNA,有研究表明,其可對(duì)成骨細(xì)胞起到一定保護(hù)作用,故促進(jìn)miR-34a-5p表達(dá)可作為治療RA的一個(gè)新靶點(diǎn)〔6〕。但其在治療RA方面目前臨床幾乎沒(méi)有研究,本文探討miR34a-5p靶向調(diào)控MMP-9對(duì)RA大鼠氧化應(yīng)激及滑膜細(xì)胞分化的作用機(jī)制

1 材料與方法

1.1動(dòng)物材料 本實(shí)驗(yàn)選取湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的70只SPF級(jí)SD雄性大鼠〔合格證書(shū)為:SCXK(湘)2020-0004〕,體質(zhì)量210～270 g,溫度26 ℃、52%相對(duì)濕度、自然光照下飼養(yǎng),按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 弗氏完全佐劑(貨號(hào):F5881,上海睿安有限公司);miR-34a-5p mimic(貨號(hào):CMR0082,廣州威佳有限公司);重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號(hào):GMS60036,上海杰美有限公司);MMP-9抑制劑鹽酸多西環(huán)素(貨號(hào):YT69064,北京伊塔有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染液(貨號(hào):BIR615,北京博爾西有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào):E100,上海普赫有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)儀(型號(hào):6000,上海鉑力有限公司);cDNA 第一鏈合成試劑盒(貨號(hào):YLK-T0057,上海優(yōu)利科有限公司);多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):Spark,北京賽百奧有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號(hào):042-02801,廣州威佳有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(貨號(hào):YT-C-A333,上海韻泰有限公司);4′,6-二氨基-2-苯基吡啶(DAPI)染色液(貨號(hào):FT21949yy,上海梵態(tài)有限公司);降鈣素受體(CTR)抗體(貨號(hào):201675-T02,北京義翹神州股份有限公司);熒光顯微鏡(型號(hào):Primo Star iLED,上?？柌趟居邢薰?。

1.3建模 隨機(jī)選取55只大鼠,進(jìn)行RA建模,大鼠固定好,后肢消毒,于足趾皮下注射0.1 ml弗氏完全佐劑,7 d后再注射1次,觀察大鼠后肢情況,當(dāng)出現(xiàn)明顯紅腫且后腫脹持續(xù),則視為建模成功,建模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡,全部建模成功。

1.4基因轉(zhuǎn)染 根據(jù)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū),將miR-NC和miR-34a-5p mimic質(zhì)粒與載體分別加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液中,并在溫室條件下孵育10 min。然后,將等量的miR-NC和miR-34a-5p mimic加入脂質(zhì)體中,并配制成轉(zhuǎn)染液。最后,將密封保存這些轉(zhuǎn)染液,以備后續(xù)的實(shí)驗(yàn)使用。

1.5分組及給藥 從建模成功的大鼠中隨機(jī)選取50只,將其分為模型(B)組,miR-NC(C)組,miR-34a-5p mimic(D)組,MMP-9抑制劑(E)組,miR-34a-5p mimic+MMP-9抑制劑(F)組,每組10只,同時(shí)隨機(jī)選取10只正常大鼠作為正常對(duì)照(A)組,對(duì)C組給予尾靜脈注射0.5 ml 1×105/ml的miR-NC,對(duì)D組給予尾靜脈注射0.5 ml 1×105/ml的miR-34a-5p mimic,對(duì)E組給予尾靜脈注射30 mg/kg的鹽酸多西環(huán)素,對(duì)F組給予miR-34a-5p mimic聯(lián)合鹽酸多西環(huán)素,每組均1次/d,持續(xù)28 d,A、B組同期給予同體積生理鹽水。

1.6標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)完成后,75 mg/kg的氯胺酮麻醉處死大鼠,腹主動(dòng)脈取血離心取上清液于冰箱中密封保存,同時(shí)取滑膜組織,常規(guī)石蠟包埋、切片,4%多聚甲醛固定96 h,放入冰箱中密封保存。

1.7HE法檢測(cè)大鼠滑膜組織病理形態(tài) 取部分滑膜組織,行脫蠟和至水處理后,用蘇木素染色5 min,酸水及氨水中分色,各5 s,流水沖洗后,用70%及90%的酒精依次脫水10 min,用伊紅染液染色2 min,染色完成后,用梯度乙醇和二甲苯進(jìn)行脫水和透明化處理,最后使用中性樹(shù)膠封片,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.8Real-time PCR 法檢測(cè)大鼠滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá) 取各組滑膜組織,trizol 試劑提取總RNA,電泳儀檢測(cè)其完整性,cDNA 第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA;利用Real-time PCR儀,在94 ℃條件下預(yù)變性10 min,變性30 s,70 ℃延伸1 min,59 ℃退火30 s,此循環(huán)進(jìn)行40次,收集miR-34a-5p、MMP-9熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以同一樣本中U6的Ct值作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt計(jì)算其基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列(5′-3′):miR-34a-5p:上游TGCGCTGGCAGTGTCTT-AGCTG、下游CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA,長(zhǎng)度145 bp;MMP-9:上游TGTACCGCTATGGTTACACTCG、下游GGCAGGGACAGTTGCTTCT,長(zhǎng)度153 bp;U6:上游CTCGCTTCGGCAGCACA、下游AACGCTTCA-CGAATTTGCGT,長(zhǎng)度128 bp。

1.9各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.9.1黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)大鼠血清中SOD水平 取各組大鼠血清,嚴(yán)格按照其實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),首先按照試劑說(shuō)明書(shū)配制好試劑,然后用均勻器進(jìn)行混勻,37 ℃水浴40 min后,在波長(zhǎng)550 nm處進(jìn)行蒸餾水凋零,實(shí)驗(yàn)完成后立即用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔光密度(OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算SOD含量。

1.9.2硫代巴比妥酸法檢測(cè)大鼠血清中MDA水平 取各組大鼠血清,嚴(yán)格按照其實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),首先按照試劑說(shuō)明書(shū)配制好試劑,然后用均勻器進(jìn)行混勻,100 ℃水浴40 min后冷卻,然后在3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液,用酶標(biāo)儀在523 nm處測(cè)定每孔OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算MDA。

1.10免疫熒光法檢測(cè)大鼠滑膜組織中破骨細(xì)胞標(biāo)志物CTR蛋白表達(dá) 取各組滑膜組織,二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化后,滴加適量pH6.0的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液,然后放入微波爐進(jìn)行組織抗原修復(fù),修復(fù)完成后冷卻至室溫,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,加入封閉液封閉30 min后,滴加稀釋的CTR一抗(1∶50),濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗滌3次,滴加稀釋后的熒光標(biāo)記的免疫球蛋白(Ig)G二抗(1∶100),濕盒中37 ℃孵育1 h,PBS洗滌4次,滴加 DAPI避光孵育5 min,PBS洗滌4次,充分洗去多余的DAPI,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,使用IPP6.0軟件對(duì)免疫熒光照片進(jìn)行光密度分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組滑膜組織HE染色結(jié)果 A組滑膜組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常且排列整齊,未見(jiàn)關(guān)節(jié)腔滲出、水腫、充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,B、C組出現(xiàn)彌漫性滑膜細(xì)胞和纖維組織增生,并可見(jiàn)大量血管翳形成及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,D、E、F組可見(jiàn)滑膜細(xì)胞輕度增生及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和新生毛細(xì)血管形成,水腫、充血情況明顯改善,見(jiàn)圖1。

圖1 各組滑膜組織(HE染色,×400)

2.2各組滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果 與A組比較,B組、C組滑膜組織中miR-34a-5p mRNA表達(dá)顯著降低,MMP-9 mRNA明顯升高(均P<0.05),B組與C組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組滑膜組織中miR-34a-5p mRNA表達(dá)顯著升高,MMP-9 mRNA顯著降低(P<0.05),且D組與E組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),而F組較E組變化顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3各組血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 與A組比較,B、C組血清中SOD含量顯著降低,MDA明顯升高(均P<0.05),B組與C組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組血清中SOD含量顯著升高,MDA顯著降低(均P<0.05),且D組與E組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),而F組較E組變化顯著(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組滑膜組織中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)及血清中SOD、MDA含量

2.4所有大鼠miR-34a-5p與MMP-9相關(guān)性 miR-34a-5p與MMP-9呈負(fù)相關(guān)(r=-0.952,P<0.001)。

2.5各組滑膜組織中CTR蛋白表達(dá)結(jié)果 A、B、C、D、E、F組滑膜組織中CRT蛋白表達(dá)(0.54±0.05、2.12±0.12、2.13±0.12、1.35±0.11、1.36±0.12、0.69±0.07),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.430,P<0.001),與A組比較,B、C組滑膜組織CTR蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),B組與C組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),與C組相比,D、E、F組滑膜組織CTR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),且D組與E組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),而F組較E組顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 各組滑膜組織CTR蛋白表達(dá)(免疫熒光,×400)

3 討 論

RA目前已被世界衛(wèi)生組織定為醫(yī)學(xué)界難治性疾病,幾乎所有患者關(guān)節(jié)功能都會(huì)出現(xiàn)不同程度的喪失,同時(shí)累及血液、消化、呼吸系統(tǒng)等多種器官,對(duì)患者及其家庭,乃至社會(huì)均造成了極大負(fù)擔(dān)〔7〕。miRNA能通過(guò)與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的mRNA結(jié)合,從而抑制或降低目標(biāo)基因的表達(dá),近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),其被發(fā)現(xiàn)在包括RA在內(nèi)的多種疾病中起著重要的調(diào)控作用〔8〕。

本研究發(fā)現(xiàn),促進(jìn)miR-34a-5p對(duì)RA具有治療作用。miR-34a-5p作為miR的一種,其可通過(guò)多種方式調(diào)控下游靶基因,進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡、增殖等多種生物學(xué)活動(dòng),同時(shí)有研究表明,其可通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞功能參與骨損傷疾病的病理過(guò)程〔9〕。RA的致病因素復(fù)雜,但有研究表明其主要與炎癥、自身免疫反應(yīng)等多種機(jī)制導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)降解引起的關(guān)節(jié)系統(tǒng)損傷有關(guān)〔10〕。MMP-9可以降解膠原蛋白,參與滑膜細(xì)胞的遷移、侵襲及滑膜血管新生等過(guò)程,高水平的MMP-9活性與RA關(guān)節(jié)炎癥的嚴(yán)重程度和滑膜細(xì)胞異常增殖有關(guān)〔11,12〕。而對(duì)于RA大鼠,miR-34a-5p激動(dòng)劑可能是通過(guò)促進(jìn)miR-34a-5p的轉(zhuǎn)錄及翻譯,來(lái)促進(jìn)其蛋白質(zhì)的合成及促進(jìn)其識(shí)別MMP-9的RNA,從而參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控、并降解MMP-9,達(dá)到影響MMP-9基因蛋白質(zhì)合成的目的,進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解、并參與細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控、抑制炎性因子的分泌、促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡等,最終有效改善疾病狀況?；粜禄鄣取?3〕研究發(fā)現(xiàn),MMP-9在RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)升高,給予治療后其水平顯著降低,這與本文結(jié)果類(lèi)似。

本研究表明,miR-34a-5p激動(dòng)劑可顯著抑制氧化應(yīng)激。SOD可清除活性氧生成過(guò)程中的初始產(chǎn)物,是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手,可保護(hù)細(xì)胞免受自由基攻擊,因此其被看作自由基的第一線防御機(jī)制;而MDA是細(xì)胞膜被氧化后形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物,在機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷中扮演著重要角色,可對(duì)細(xì)胞具有直接的損傷作用,其含量的多少反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度,同時(shí)也是組織器官損傷的重要標(biāo)志,因此SOD及MDA均是反映氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)〔14,15〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),在RA中,氧化應(yīng)激水平升高會(huì)引起滑膜細(xì)胞的功能失調(diào)和炎癥的發(fā)生,因此如何抑制氧化應(yīng)激是目前臨床工作的重點(diǎn)所在〔16〕。對(duì)于RA大鼠,miR-34a-5p激動(dòng)劑可能是通過(guò)抑制上游免疫細(xì)胞的活化及相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá),來(lái)抑制細(xì)胞凋亡因子在滑膜細(xì)胞中的表達(dá)、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解等,從而抑制鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制多種黏附分子基因表達(dá)劑細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制部分蛋白酶的活性,并改善細(xì)胞膜的流動(dòng)性及通透性,進(jìn)而有效清除氧自由基、到達(dá)抑制氧化應(yīng)激水平,減少血小板聚集和血栓形成的目的,最終有效改善疾病癥狀。孫艷秋等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),RA中SOD含量顯著降低,MDA顯著升高,Linc00638在RA患者中低表達(dá),過(guò)表達(dá)Linc00638可顯著改善氧化應(yīng)激指標(biāo),這與本文結(jié)果類(lèi)似。

本研究說(shuō)明,miR-34a-5p激動(dòng)劑可有效抑制滑膜細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。RA屬于慢性自身免疫性疾病,以侵蝕性、對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn),其一個(gè)典型病理特征就是骨破壞,因此如何抑制骨破壞是近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一〔18〕。而破骨細(xì)胞是造成RA骨破壞的關(guān)鍵細(xì)胞,其主要來(lái)源于關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的分化,其中CTR是破骨細(xì)胞表面的標(biāo)志性分子,故其水平的變化可有效反映滑膜細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的程度〔19〕。而對(duì)于RA大鼠,miR-34a-5p激動(dòng)劑可能是通過(guò)調(diào)控免疫炎癥相關(guān)信號(hào)通路,來(lái)抑制免疫炎癥反應(yīng),從而參與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞器的形成,影響破骨樣分化因子的生成,進(jìn)而抑制滑膜細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞,到達(dá)抑制破骨細(xì)胞活性的目的,最終有效減輕骨損傷。賀龍剛等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),RA中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多,給予治療后,破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,病理癥狀明顯改善,這與本文結(jié)果類(lèi)似。