陳 東， 楊 逍， 宋達峰*

（1.杭州安旭生物科技股份有限公司， 浙江 杭州 310000；2.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 浙江 杭州 310000）

核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）是一種人畜共患病原菌，也被稱為高致病性兼容細胞有機體[1]，被其污染的食物可導(dǎo)致人類感染[2]。 在美國每年有1 600 多人感染該病菌，200 多人死亡[1]。 20世紀(jì)90 年代，WHO 將單增李斯特菌列為食品四大病原菌之一。 單核細胞增生李斯特菌可突破血腦屏障或是胎盤屏障，有極大的可能性會感染宿主中樞神經(jīng)，這也是高死亡率（20%～30%）的主要原因[3-5]。目前國標(biāo)檢測常用生化鑒定法， 該方法步驟煩瑣、檢測周期長、特異性低，無法做到快速靈敏檢測[6]，在市場檢測中實用性差， 酶聯(lián)熒光分析法（ELISA）則不夠準(zhǔn)確高效。 到目前為止，由于食品形態(tài)和成分的多樣，單一配方的培養(yǎng)基無法適用于所有類型食物樣品中單增李斯特菌的分離， 需分門別類培養(yǎng)，操作非常不方便。 而逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（RT-LAMP）則可以很好地解決以上問題，既保留了逆轉(zhuǎn)錄檢測技術(shù)的高效精確，又結(jié)合了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）的簡便操作，該方法可同時檢測多批樣本，成本較低，結(jié)果判定簡單。 作者首次采用RT-LAMP 技術(shù)對8 株單增李斯特菌和33 株非單增李斯特菌進行特異性試驗，研究不同條件下對單增李斯特菌的iap 基因的檢測效果， 此外還探討了死菌附著于樣本對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。 本實驗以國家標(biāo)準(zhǔn)檢測法為對照， 以確認RT-LAMP 的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種

分析了來自不同國家和來源的39 種細菌菌株，見表1。

表1 RT-LAMP 實驗菌株Table 1 RT-LAMP experimental strains

1.2 主要試劑

AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑、 細菌總RNA 快速抽提試劑盒、LAMP 引物及PCR 引物：上海生工生物工程科技有限公司；DNA 提取試劑盒：Axygen 公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計在GeneBank 中查找單核細胞增生李斯特菌的iap 基因的基因序列， 用Primer Explorer V4（Eiken Chemical，Japan）設(shè)計了4 個引物，包括2 個外引物（LM-F3 和LM-B3）和2 個內(nèi)引物（LM-FIP 和LM-BIP），它們識別了iap 基因的6個區(qū)域，見圖1。

圖1 iap 基因引物在單核細胞增生李斯特菌中的位置和序列Fig.1 Location and sequence of iap gene primers in Listeria monocytogenes

1.3.2 DNA 和總RNA 的提取按照細菌總RNA快速抽提試劑盒（Sangon Biotech）和DNA 提取試劑盒（Axygen） 的操作說明分別提取DNA 和總RNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 優(yōu)化RT-LAMP 體系根據(jù)裴靈芝的RTLAMP 研究[7]，進行微調(diào)后設(shè)定RT-LAMP 初始的基本反應(yīng)體系(25 μL)為：緩沖液1×ThermoPol?，dNTPs 0.8 mmol/L，MgSO42.0 mmol/L，LM-FIP 0.8 μmol/L，LM-BIP 0.8 μmol/L，LM-F3 0.4 μmol/L，LM-B3 0.4 μmol/L，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶10 U/μL， 甜菜堿1.0 mol/L，Bst DNA 聚合酶320 U/mL，RNA 2 μL，63 ℃孵育1 h。 用控制單一變量的方法對甜菜堿（0、0.5、1.0、1.5 mol/L），MgSO4（1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L），dNTPs（1.2、1.6、2.0、2.4 mmol/L）和Bst DNA 聚合酶（40、80、160、320 U/mL）和引物的孵育溫度（59、61、63、65 ℃）進行優(yōu)化。

1.3.4 RT-LAMP 的特異性實驗用8 株單核細胞增生李斯特菌和31 株非單核細胞增生李斯特菌菌株按照試劑盒說明提取RNA， 用最優(yōu)的RT-LAMP體系進行實驗， 觀察凝膠電泳結(jié)果來判斷RTLAMP 的特異性。

1.3.5 RT-LAMP 的靈敏度實驗用純單核細胞增生李斯特菌培養(yǎng)物(J0161)測定RT-LAMP 靈敏度。10 倍稀釋法處理培養(yǎng)物，從中提取RNA，并在最佳反應(yīng)條件下進行RT-LAMP。 用上述方法按照試劑盒說明提取DNA 并測試LAMP 的靈敏度， 將瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與RT-LAMP 進行比較。

1.3.6 用RT-LAMP 和LAMP 檢測活菌和死菌作者測試了當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的50 個肉類樣品， 以確定RT-LAMP 是否能有效區(qū)分死細菌和活細菌。 將每個肉類樣品勻漿后，用105CFU/dL 的單增李斯特菌感染40 個肉樣品， 并將等濃度滅活菌液接種于剩余10 個肉類樣品。 將每種培養(yǎng)物振蕩培養(yǎng)后，離心取上清液提取DNA 和RNA， 分別用LAMP 和RT-LAMP 進行實驗并分析結(jié)果。

1.3.7 檢測肉樣中的單核細胞增生李斯特菌將RT-LAMP 檢測法和中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30—2016 法分別用于分析從中國當(dāng)?shù)厥袌霁@得的100個肉樣品， 以確定RT-LAMP 鑒定肉中單核細胞增生李斯特菌的能力。 取每種肉類樣品勻漿，離心并從上清液中提取RNA。采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30—2016 檢測每種肉類樣品，已證實了單核細胞增生李斯特菌菌落的存在。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計

引物序列見表2。設(shè)計了4 個引物，包括2 個外引物（LM-F3 和LM-B3）和2 個內(nèi)引物（LM-FIP 和LM-BIP），它們識別了iap 基因的6 個區(qū)域，見表2。

表2 iap 基因的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences of iap gene

2.2 優(yōu)化RT-LAMP 體系

優(yōu)化RT-LAMP 實驗結(jié)果見圖2。 在MgSO4濃度為2.0 mmol/L 時可以擴增iap， 而在其他濃度下不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。 隨著dNTPs 濃度的增加，瓊脂糖凝膠上的RT-LAMP 產(chǎn)物條帶強度增加， 在dNTPs濃度為2.0 mmol/L 時觀察到最佳條帶。 添加1.0 mol/L 甜菜堿后，條帶檢測更清晰，但當(dāng)甜菜堿濃度從1.0 mol/L 增加到1.5 mol/L 時沒有觀察到明顯的差異； 隨著反應(yīng)體系中Bst DNA 聚合酶濃度的增加， 擴增產(chǎn)物在320 U/mL Bst DNA 聚合酶下觀察到最佳擴增。 模板在59～65 ℃成功擴增，并且在63℃產(chǎn)生最明顯的條帶。 基于這些結(jié)果，RT-LAMP 測定條件為：MgSO42.0 mmol/L，dNTPs 2.0 mmol/L，甜菜堿1.0 mol/L，Bst DNA 聚合酶320 U/mL， 擴增溫度63 ℃。 這些參數(shù)用作所有后續(xù)實驗的標(biāo)準(zhǔn)條件。

圖2 RT-LAMP 體系優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of RT-LAMP system

2.3 RT-LAMP 的特異性試驗

設(shè)計的引物擴增了來自8 個單增李斯特菌菌株的iap 基因， 但沒有擴增來自非單增李斯特菌的iap 序列。 因此，RT-LAMP 試驗特異性地檢測單增李斯特菌，沒有假陽性結(jié)果，見圖3。

圖3 RT-LAMP 特異性結(jié)果Fig.3 RT-LAMP specific results

2.4 RT-LAMP 的靈敏度試驗

從單核細胞增生李斯特菌純培養(yǎng)物的5 個連續(xù)稀釋液中提取RNA（稀釋10 倍），在最佳反應(yīng)條件下進行RT-LAMP 檢測。 在2 g/dL 瓊脂糖凝膠上觀察， 低于7.3×101CFU/mL 時沒有明顯的擴增產(chǎn)物，見圖4（a）。 比較LAMP 和RT-LAMP 的靈敏度，LAMP 的 靈 敏 度 為1.4×102CFU/mL， 低 于RTLAMP，見圖4（b）。

圖4 RT-LAMP 和LAMP 靈敏度結(jié)果Fig.4 Sensitivity results of RT-LAMP and LAMP

2.5 活菌和死菌的RT-LAMP 和LAMP 檢測

RT-LAMP 的測定結(jié)果見表3。在含有死單增李斯特菌的10 個樣品中結(jié)果為陰性， 但在LAMP 測試的所有10 個樣品中均為陽性， 而活菌污染樣本則均被檢出陽性。

表3 RT-LAMP 和LAMP 檢測死菌和活菌Table 3 Detection of dead and living bacteria using RTLAMP and LAMP

2.6 肉樣中存活的單核細胞增生李斯特菌檢測

100 個肉樣品RT-LAMP 分析數(shù)據(jù)與國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30—2016 的數(shù)據(jù)比較結(jié)果見表4。 RTLAMP 和GB 測定均鑒定出3 種單核細胞增生李斯特菌陽性樣品，證實了RT-LAMP 測定的準(zhǔn)確性。

表4 RT-LAMP 和GB 法檢測肉樣中的單核細胞增生李斯特菌Table 4 Detection of Listeria monocytogenes in meat samples using RT-LAMP and GB methods

3 結(jié) 語

作者首次用RT-LAMP 以iap 基因為靶基因設(shè)計引物檢測肉樣中單增李斯特菌， 在傳統(tǒng)的LAMP技術(shù)上作了延伸。此外，根據(jù)RT-LAMP 原理對反應(yīng)體系進行優(yōu)化，對該方法性能進行評估，并與國標(biāo)進行對比。 實驗結(jié)果表明，RT-LAMP 在7.3×101CFU/mL 培養(yǎng)物中即可檢出單增李斯特菌， 具有高靈敏度。 且在特異性實驗中沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果，特異性強。 采用RT-LAMP 在7.3×101CFU/mL 的培養(yǎng)物中檢測到單增李斯特菌， 靈敏度是LAMP 的2倍。 在活菌和死菌的檢測實驗中，與LAMP 技術(shù)相比，RT-LAMP 只對活菌進行擴增，可以區(qū)分活細菌和死細菌， 避免假陽性結(jié)果， 且鑒別能力較強，而GB 方法難以做到。 在隨后的可行性實驗中，RTLAMP 檢測結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30—2016 方法相同，但整體準(zhǔn)確度更高，這表明它可以更快、更準(zhǔn)確地檢測單增李斯特菌，有望取代GB 4789.30—2016。實驗結(jié)果還顯示，MgSO4的濃度對引物結(jié)合和Bst 活性的影響最大， 鎂離子的濃度不適合整個體系就不會得到擴增結(jié)果，這與之前的研究結(jié)果一致[8]。同時甜菜堿在體系中的作用值得探討，雖然其他人報道在RT-LAMP 中加入甜菜堿只能適度提高反應(yīng)性能[9]，但在本實驗中觀察到擴增產(chǎn)物明顯增加（1.0 mol/L 甜菜堿是最佳）。 這一現(xiàn)象可能與甜菜堿增強RNA 對Bst DNA 聚合酶的易接近能力有關(guān)[10]。

綜上所述，RT-LAMP 技術(shù)檢測肉樣中單增李斯特菌具有特異性和良好的靈敏度， 相比GB 方法對死菌活菌的辨別準(zhǔn)確，避免了消毒滅菌后死菌殘留或因其他原因出現(xiàn)死菌情況下對食品衛(wèi)生程度的誤判[11-13]。 相比于傳統(tǒng)生化方法，此技術(shù)節(jié)省了菌落培養(yǎng)分離所需的時間，減少了工作量，并能做到即取即測。 同時該技術(shù)延續(xù)了LAMP 技術(shù)的優(yōu)點，儀器成本低且操作便捷，為食源性致病菌的快速高效檢測提供了新途徑。