李超群， 石 娟， 周麗萍， 王 晴， 婁永江

（寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832）

大黃魚肉嫩味鮮，富含蛋白質(zhì)、維生素及微量元素等，是我國六大優(yōu)勢養(yǎng)殖水產(chǎn)品和主要海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一[1-3]。 海水魚在內(nèi)源性酶降解、脂肪氧化和微生物作用下，極易腐敗變質(zhì)，其中微生物生長及代謝起決定性作用[4]。 隨著人們生活水平的提高，食品安全性已成為各國普遍關(guān)注的重大問題，為了避免食物致病菌威脅人體健康，研發(fā)綠色、高效、環(huán)保的抗菌劑對海產(chǎn)品的鮮度保持、儲存和銷售有著十分重要的意義[1，5]。 生物抗菌劑的有效成分含量低、天然成分提取難度大、成本高[6]，因此探索安全有效的新型復(fù)合無機抗菌劑正成為研究熱點，但目前相關(guān)報道還較少。

在自然界中很多金屬離子具有抑制和殺滅微生物的作用，其中銀離子在所有金屬離子中抗菌能力最強，濃度低、效果好、安全無毒[7]。 載銀羥基磷灰石（AgHAp）在醫(yī)學(xué)和陶瓷等抗菌處理中廣泛應(yīng)用，且有研究證明載銀羥基磷灰石（AgHAp）具有緩釋性、抗菌持久性和生物安全性等特點[8-10]，但目前還需進一步探索銀納米材料新的應(yīng)用領(lǐng)域。

由于銀價格昂貴，在光照和紫外線條件下其抗菌效果會降低，導(dǎo)致載銀羥基磷灰石的應(yīng)用受到很大限制[5]。 二氧化鈦（TiO2）作為食品添加劑和抗菌劑[11-13]，具有光催化能力，成本低，不但可以殺死絕大多數(shù)的微生物，還能降低有機污染，在殺菌的過程中不消耗自身體積，具有持久的抗菌性能[14]。綜合AgHAp 和TiO2兩者的優(yōu)點， 將銀離子與二氧化鈦結(jié)合在一起，當沒有光或紫外線時，銀離子單獨發(fā)揮抗菌作用；當有光或紫外線時，不僅二氧化鈦能發(fā)揮光催化作用殺死細菌， 而且銀離子也能抗菌，因此可制備一種兼具光催化抗菌和金屬抗菌功能的新型抗菌劑，既可以降低銀含量，同時又能獲得更加高效持久的抗菌效果[5，15]。

作者采用貽貝殼制備的AgHAp 和Ag-HA/TiO2抗菌劑，首先通過X 射線衍射（XRD）、傅里葉紅外光譜（FTIR）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPOES）觀察載銀羥基磷灰石/二氧化鈦（Ag-HA/TiO2）的結(jié)構(gòu)表征， 并探討了貽貝殼AgHAp 和Ag-HA/TiO2的抗菌性能，以期研究載銀羥基磷灰石加入二氧化鈦后對其結(jié)構(gòu)和抗菌效果的影響。 選用2 種常見的水產(chǎn)品特定腐敗菌 （SSOs）——熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，研究載銀羥基磷灰石/二氧化鈦是否對SSOs 菌群有抗菌效果， 以及載銀羥基磷灰石/二氧化鈦抗菌材料對大黃魚中微生物變化的影響，旨在提高貝殼的資源利用率和產(chǎn)品附加值， 為Ag-HA/TiO2抗菌劑在水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料以貝殼為原料自制的球形羥基磷灰石，送中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所檢測為純羥基磷灰石。

1.1.2 實驗菌種大腸桿菌 （Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella baltica）、 熒 光 假 單 胞 菌（P.fluorescens）：均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 實驗試劑LB 液體培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基、PCA 培養(yǎng)基： 杭州微生物試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3）、二氧化鈦（TiO2）：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

渦旋儀MX-S：美國Scilogex 公司；X 射線粉末衍射儀（XRD）：D8 Advance，Bruker 公司；智能型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）：Nicolet 6700，美國Thermo Fisher 公司； 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPOES）：SPECTRO ARCOS 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 AgHAp 和Ag-HA/TiO2 的 制 備4 g HA 加入100 mL 水，超聲波分散，加入100 mL 質(zhì)量濃度為2 g/L 的硝酸銀，常溫反應(yīng)7 h，過濾，去離子水洗滌，60 ℃烘干，研磨過300 目篩得載銀羥基磷灰石。有光條件下制得灰黑色AgHAp 粉末樣品， 避光條件下制得棕黃色AgHAp 粉末樣品。

將5.3 g 的TiO2加入4 g HA，靜置24 h，去離子水清洗，避光環(huán)境下加入50 mL 質(zhì)量濃度為2 g/L的硝酸銀反應(yīng)7 h，洗滌烘干，研磨過300 目篩制得Ag-HA/TiO2復(fù)合材料樣品。

1.3.2 表征方法

1）XRD 標 識X 射 線、Cu-Kα 輻 射， 波 長0.154 06 nm，電壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍5°～90°，每步掃描時間為0.2 s，溫度20 ℃，相對濕度50%。 使用高分子樣品架將樣品用平板玻璃壓平，X 射線衍射儀測量。

2）FTIR 溴化鉀（KBr）壓片，掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32 次/min。

3）ICP-OES 將制得的樣品各取0.5 g，根據(jù)國標法溶解于100 mL 稀硝酸（V硝酸∶V水=5∶95）中，溶解后取1 mL 定容到250 mL，之后用ICP-OES 測試溶液中元素的濃度[16]。

1.3.3 Ag-HA/TiO2 的抗菌性測定

1）AgHAp 和Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能 分別取10 mg 的灰黑色和棕黃色AgHAp、Ag-HA/TiO2、 山梨酸鉀放入10 mL試管中備用，另準備空白試管做對照[17]。 用0.9 g/dL的生理鹽水制備菌懸液，進行10 倍稀釋法，選擇2～3 個適宜稀釋度， 取1 mL 菌懸液加入上述試管中。將上述試管在200 r/min、37 ℃的搖床中搖動2 h，取0.1 mL 涂布平板，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，計菌落總數(shù)。

式中：I 為抑菌率，%；C0為空白組實驗中的細菌數(shù)量，CFU/mL；C 為樣品組實驗中的細菌數(shù)量，CFU/mL。

2）Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC） 用0.9 g/dL 的生理鹽水制備105CFU/mL 的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，放入4 ℃冰箱中備用[9]。取0.04 g 的Ag-HA/TiO2抗菌材料放入試管中，然后加入2 mL 營養(yǎng)培養(yǎng)液，超聲處理使其充分混合，將懸濁液進行連續(xù)6 次兩倍稀釋， 另準備空白試管， 只加入1 mL 營養(yǎng)培養(yǎng)液，然后在每支試管中加入0.05 mL 的菌懸液。將上述試管置于37 ℃、200 r/min 的搖床中培養(yǎng)18～24 h。在培養(yǎng)結(jié)束前1 h 停止搖晃，使懸濁液沉淀，將加抗菌粉體的試管與沒有加抗菌粉體的試管做對照，處理液濁度和對比液濁度相等的體系中抗菌劑的質(zhì)量濃度即為MIC。

1.3.4 Ag-HA/TiO2 對SSOs 菌種的抗菌性能測定選用2 種在水產(chǎn)品中常見的優(yōu)勢細菌——熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌， 分別取10 mg Ag-HA/TiO2、山梨酸鉀放入10 mL 試管中備用，另準備空白試管做對照。用0.9 g/dL 的生理鹽水制備菌懸液，采用10 倍稀釋法， 選擇2～3 個適宜稀釋度， 取1 mL菌懸液加入上述試管中。 將上述試管于200 r/min、30 ℃的搖床中搖動0.5、1.0、1.5 h。 從上述試管中取0.1 mL 涂布平板，放入30 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h，計菌落總數(shù)，抑菌率計算同上。

1.3.5 Ag-HA/TiO2 對大黃魚抑菌性能測定將若干相同質(zhì)量的大黃魚肉塊置于0、0.125、0.25 g/dL的Ag-HA/TiO2懸濁液中浸泡5 min， 以及在0.125 g/dL 的Ag-HA/TiO2懸濁液中浸泡0、5、15、25 min，取出瀝凈水分，按不同的浸泡方法分別裝入多個無菌封口袋中，并置于4 ℃條件下。 根據(jù)GB 4789.2—2016 《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》分別測試1、3、5、7 d 下的菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

XRD、FTIR、ICP-OES 的數(shù)據(jù)為中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所測試中心獲取。 使用Origin 9.0 及SPSS 進行作圖和數(shù)據(jù)分析處理， 每組實驗重復(fù)3 次，圖中不同字母代表樣品存在顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 XRD 表征分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

如圖1 所示，AgHAp（樣品a、樣品b）的XRD圖譜與HA 圖譜很相似，在2θ 為26°、32°、34°、40°、47°和50°附近都有其特征峰，2 個圖譜比較相近，說明載銀后羥基磷灰石仍然保持原有的晶形結(jié)構(gòu)[18]。Ag-HA/TiO2（樣品d）也都有羥基磷灰石的特征峰，說明也保持了原有的晶形結(jié)構(gòu)， 但TiO2特征峰2θ為32°，與HA 的特征峰重疊了，說明鈣離子部分被銀離子取代，導(dǎo)致晶格常數(shù)增大[9]。

圖1 樣品a、b、d 的XRD 圖譜Fig.1 XRD patterns of samples a, b and d

2.2 FTIR 表征定性分析

圖2 為AgHAp （樣品a、 樣品b）、Ag-HA/TiO2（樣品d）的紅外圖譜。 在AgHAp 光譜圖中，在3 440、1 636、1 443、1 037、862、604、566 cm-1處存在明顯吸收峰， 其中566、604、862、1 037 cm-1處的吸收峰為PO43-振動引起；在1 443 cm-1產(chǎn)生的分裂峰可能由于碳酸進入羥基磷灰石內(nèi)部造成，是由于空氣中的二氧化碳進入反應(yīng)體系中，替代羥基磷灰石中的羥基產(chǎn)生[19]；在1 636、3 440 cm-1處的吸收峰為羥基—OH 吸收峰。 這些都說明AgHAp 基本結(jié)構(gòu)是由羥基磷灰石架構(gòu)組成。

a：灰黑色AgHAp；b：棕黃色AgHAp；d：Ag-HA/TiO2。

在HA 同時載銀和TiO2后，其吸收峰光譜吸收峰位置并沒有發(fā)生明顯改變，但在862 cm-1處的吸收峰消失，604 cm-1和566 cm-1處的吸收峰強度明顯減弱并且呈寬化的趨勢，主要是由于PO43-振動峰與TiO2（600～400 cm-1） 的耦合振動產(chǎn)生， 說明AgHAp 和TiO2復(fù)合效果較好[5]。

2.3 ICP-OES 表征測定元素質(zhì)量分數(shù)

根據(jù)呂國玉[5]和馮晉陽[20]等的研究，不管在光照還是無光的情況下，AgHAp 中銀離子的質(zhì)量分數(shù)一般在3.00%左右。Ag-HA/TiO2中銀離子的質(zhì)量分數(shù)為1.76%，鈦離子的質(zhì)量分數(shù)為31.5%，銀離子質(zhì)量分數(shù)明顯降低。

2.4 Ag-HA/TiO2 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能

2.4.1 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖3 為不同實驗材料作用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌結(jié)果。 AgHAp（樣品a、樣品b）和Ag-HA/TiO2（樣品d）的抗菌效果與山梨酸鉀有顯著性差異，AgHAp 和Ag-HA/TiO2之間沒有顯著性差異，但是灰黑色的AgHAp（樣品a）抗菌效果略弱于棕黃色的AgHAp（樣品b）和Ag-HA/TiO2，說明銀離子在光照條件下變色導(dǎo)致抗菌效果減弱。 樣品a 對大腸桿菌的抑菌率為（98.04±0.78）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（99.58±0.32）%；樣品b 對大腸桿菌的抑菌率為100%， 對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（99.67±0.47）%，與其他研究中鈣磷鹽和銀離子制備的AgHAp 抗菌效果接近[21-22]，說明貝殼粉AgHAp可以代替鈣磷鹽AgHAp，達到提高貝殼資源利用率和節(jié)約成本的作用。 可以看出，Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均為100%， 說明其抗菌效果沒有因為銀離子質(zhì)量分數(shù)的降低而減弱， 且TiO2的加入使銀離子和TiO2發(fā)揮協(xié)同作用獲得了更好的抗菌效果，不僅增強抗菌性，還可能由于TiO2對光的吸收作用抑制銀離子的變色，進一步延長Ag-HA/TiO2的抗菌持久性。

圖3 不同抗菌粉體對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果Fig.3 Antibacterial effects of different antibacterial powders on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4.2 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度 （MIC）Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 值均為312.5 μg/mL， 測試數(shù)據(jù)符合日本抗菌協(xié)會制定的《銀等無機抗菌劑的自主規(guī)格及其抗菌試驗法》中規(guī)定的無機抗菌劑抗菌性能要求，MIC 值小于800 μg/mL[5，23]。 在實際應(yīng)用中，高載銀量一方面會提高生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。 另一方面可能會造成銀離子超標，引起重金屬污染[23]，因此盡量降低載銀量。

2.5 Ag-HA/TiO2 對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的抑菌效果

圖4～5 為Ag-HA/TiO2和山梨酸鉀對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌抑菌率的柱狀圖。 可以看出，樣品對菌種的抗菌效果隨著作用時間的增長沒有顯著性差異， 但Ag-HA/TiO2的抗菌效果明顯比山梨酸鉀的抗菌效果要好。而Ag-HA/TiO2與熒光假單胞菌的作用時間為0.5 h 時抑菌率為（97.58±3.43）%，1.0 h 和1.5 h 時抑菌率為100%； 與腐敗希瓦氏菌在3 個不同作用時間的抑菌率均為100%。 實驗樣品的菌落總數(shù)顯著低于對照樣品，表明Ag-HA/TiO2抗菌劑對這2 種水產(chǎn)品特定腐敗菌有很強的抑菌作用，有望成為一種較理想的水產(chǎn)保鮮材料。

圖4 不同作用時間下樣品對熒光假單胞菌的抑菌率Fig.4 Inhibition rate of samples against Pseudomonas fluorescens under different treated time

圖5 不同作用時間下樣品對腐敗希瓦氏菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of samples against Shewanella putrefaction under different treated time

2.6 Ag-HA/TiO2 處理對大黃魚中微生物的影響

魚死后，隨著冰藏時間的延長，其體內(nèi)微生物的增長和繁殖是導(dǎo)致魚肉腐敗變質(zhì)的主要原因，因此，在貯藏過程中檢測魚肉中微生物動態(tài)變化能夠反映魚體新鮮程度[24]。 如圖6 所示，在貯藏初期，3組的菌落總數(shù)相差不大， 隨著貯藏時間的加長，0 g Ag-HA/TiO2處理后菌落總數(shù)在第7 天為（5.34±0.1）lg （CFU/g），增長最快；0.125 g Ag-HA/TiO2處理后的菌落總數(shù)在第7 天為 （5.06±0.05） lg （CFU/g）；0.250 g Ag-HA/TiO2處理后的菌落總數(shù)在第7 天為（4.8±0.04） lg （CFU/g），增長最慢，菌落總數(shù)也明顯低于其他2 組， 說明在浸泡作用時間同為5 min 的情況下，隨著Ag-HA/TiO2質(zhì)量的增加，抑菌效果變好。0 g 與0.125、0.250 g Ag-HA/TiO2處理后的大黃魚具有顯著性差異，Ag-HA/TiO2處理后大黃魚抑制細菌生長效果明顯。 參考標準規(guī)定一級鮮肉菌落總數(shù)小于4 lg （CFU/g），0 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黃魚在第1 天菌落總數(shù)為（4.23±0.04） lg （CFU/g）的情況下，0.25 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黃魚第5 天菌落總數(shù)為（3.87±0.15） lg （CFU/g），未超過4 lg （CFU/g），延長了一級鮮肉貨架期[25-27]。

圖6 不同質(zhì)量Ag-HA/TiO2 處理后大黃魚貯藏期間菌落總數(shù)的變化Fig.6 Changes of the total number of colonies of large yellow croaker treated with different content of Ag-HA/TiO2 during storage

由圖7 可以看出， 隨著冰藏時間的延長，Ag-HA/TiO2浸泡時間越長抑菌效果越好。 浸泡時間為0 min 時，在大黃魚菌落總數(shù)為（4.16±0.06）lg （CFU/g）的情況下，浸泡15 min 時第1 天菌落總數(shù)為（3.84±0.04） lg （CFU/g），符合一級鮮肉標準；浸泡25 min時第5 天菌落總數(shù)為（3.70±0.09） lg （CFU/g），仍未超過一級鮮肉標準， 與在0.250 g 的Ag-HA/TiO2中浸泡5 min 時延長貨架期的效果相同。

圖7 Ag-HA/TiO2 處理不同時間大黃魚后貯藏期間菌落總數(shù)的變化Fig.7 Changes in the total number of colonies of large yellow croaker treated with Ag-HA/TiO2 for different time during storage

由圖6～7 可以看出， 經(jīng)過Ag-HA/TiO2浸泡液處理過的大黃魚與未經(jīng)過處理的大黃魚菌落總數(shù)有明顯差異，菌落總數(shù)在1～5 d 抑菌效果明顯，且隨著質(zhì)量和時間的增加， 在3～5 d 菌落總數(shù)甚至開始出現(xiàn)下降的情況， 證明在這段時間內(nèi)Ag-HA/TiO2抑制和殺滅細菌的效果最好。

3 結(jié) 語

為了降低AgHAp 的銀離子質(zhì)量， 同時又能獲得高效的抗菌性，將AgHAp 和TiO2結(jié)合起來，制備的Ag-HA/TiO2的銀離子的質(zhì)量分數(shù)降低為1.76%，負載銀和TiO2后HA 晶體結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化；貝殼AgHAp 的抗菌效果與鈣磷鹽AgHAp 抗菌效果接近，解決傳統(tǒng)上鈣磷鹽成本大和廢棄貝殼污染環(huán)境的問題；Ag-HA/TiO2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均為100%， 最小抑菌質(zhì)量濃度均為312.5 μg/mL， 效果優(yōu)于AgHAp；10 mg/mL Ag-HA/TiO2作用0.5 h 時對假單胞菌和希瓦氏菌的抑菌率分別為（97.58±3.43）%和100%，作用時間1.0、1.5 h時抑菌率均為100%，抑菌效果強；Ag-HA/TiO2能抑制大黃魚中細菌的生長， 延長一級鮮肉的貨架期，為食品安全問題提供了有效途徑，但其保鮮能力還需進一步研究。