焦 明， 羅玉霞， 陳亞男， 舒 倫， 吉林臺， 金 山*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.阿拉善左旗農(nóng)牧區(qū)生態(tài)管理綜合行政執(zhí)法局，內(nèi)蒙古 巴彥浩特 750325；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，隨著涉及食品病原菌和腐敗菌的食品安全事故頻發(fā)， 每年約有10 億人食物中毒，約42 萬人因食物中毒死亡，因此人們越來越關(guān)注食品安全問題。 其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和單增李斯特桿菌為主要致病菌。 利用乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，尤其是通過細菌素來抑制食品病原菌和腐敗菌越來越得到人們的認同[1-2]。 細菌素是一種無抗藥性、無殘留的天然蛋白質(zhì)[3]，能夠防止食品腐敗變質(zhì)，延長食品保質(zhì)期[4]，作為食品添加劑替代品有一定潛力[5]。

細菌素是細菌代謝過程中通過核糖體合成的一類抑菌肽[6]，具有抗細菌、真菌等作用[7]，主要分為四大類：Ⅰ類細菌素為含有修飾氨基酸的多肽[8]；Ⅱ類細菌素為不含修飾氨基酸的多肽；Ⅲ類細菌素為大相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)[9]，此類細菌素在核糖體生成后不經(jīng)修飾，相對分子質(zhì)量大于10 000[10]；Ⅳ類細菌素為復(fù)合型大分子復(fù)合物，由于其帶正電荷且具有疏水性，故可以和粗提物中其他大分子物質(zhì)聚合形成復(fù)合物[11]。

片球菌素屬于Ⅱa 類細菌素， 主要由乳酸片球菌、戊糖片球菌、小片球菌產(chǎn)生[12]。 片球菌素PA-1的操縱子由pedA、pedB、pedC、pedD 組成，pedA 為其結(jié)構(gòu)基因。 片球菌素具有耐熱性，對許多革蘭氏陽性菌有抑制作用，對部分革蘭氏陰性菌也有抑制作用，顯示了較寬的抑菌普。 另外片球菌素具有高等電點和親水特性，乳酸片球菌素的抑菌活性與分子結(jié)構(gòu)也有一定關(guān)系。 乳酸片球菌素的分子結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量上升，β-折疊、轉(zhuǎn)角含量降低的時候，乳酸片球菌素的活性也降低[13]。 但是天然的細菌素產(chǎn)量有限，純化困難，目前主要通過發(fā)酵法[14]和化學(xué)合成法[15]大量獲取，但二者的成本都相對較高，產(chǎn)量較低，并且化學(xué)合成的細菌素活性不穩(wěn)定。 近年來隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展， 原核表達技術(shù)日趨成熟，因此通過原核表達來獲取大量細菌素也是比較好的選擇[16-17]。 此外，從各個乳酸菌菌株中發(fā)掘潛在的細菌素（如鼠李糖乳桿菌）[18]，以及用納米技術(shù)提高細菌素穩(wěn)定性和作用力也是未來的趨勢[19-20]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸片球菌R-4 和金黃色葡萄球菌：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室保存；E.coli DH5α 感受態(tài)細胞、pMD19-T 載體、pET-32a（+）載體、T4 DNA 連接酶、rTaq DNA 聚合酶、dNTP、SacⅠ和Hind III 限制性核酸內(nèi)切酶：寶生物工程（大連）有限公司；E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；核酸染料：北京泰克生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量核酸DNA Marker DL-2000、DNA Marker DL-5000、 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（180 000）：碧云天生物科技有限公司；氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷： 美國西格瑪奧德里奇公司；細菌基因組提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、Tris、SDS、Alycine、 考馬斯亮藍R-250：天根生化科技（北京）有限公司；LB 培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；透析袋MD55、過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、 脫脂奶粉、TBST、PVDF 膜、BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；小鼠抗Histag 單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP：北京博奧賽生物技術(shù)有限公司；Super ECL PLUS： 蘇州宇恒生物 科 技 有 限 公 司；Binding/Wash Buffer、Elution Buffer、Ni-NTA Sefinose（TM） Resin：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋：日本SANYO 公司；恒溫生化培養(yǎng)箱： 美國熱電公司； 核酸電泳儀、SDS-PAGE 電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；高速離心機、冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電子天平：美國頗爾公司；多功能酶標(biāo)儀、PCR 儀：基因有限公司；脫色搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；核酸凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：美國熱電公司。

1.3 研究方法

1.3.1 克隆載體pMD19-T-pedA 構(gòu)建根據(jù)NCBI上GenBank 公布的pedA 基因序列（Accession number M83924） 設(shè)計帶有保護性堿基和酶切位點的 引 物P.P-F：5′-AACCCCGAGCTCGCAAAAAAA TTGAAAAATTAACT-3′和引物P.P-R：5′-CCCGGG AAGCTTGACTAGCATTTATGATTACCTTG-3′。 引物帶有的酶切位點分別是SacⅠ和Hind III。提取乳酸片球菌R-4 的DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 對pedA 基因片段進行擴增。PCR 反應(yīng)體系如下：3.0 μL 乳酸片球菌R-4 DNA，2.5 μL 10×Taq 緩沖液，2.0 μL dNTP 混合液，2.0 μL Mg2+，0.5 μL rTaq 酶，1.0 μL 引物P.P-F （質(zhì)量濃度10 mg/mL），1.0 μL 引物P.P-R （質(zhì)量濃度10 mg/mL）；13.0 μL ddH2O，總體系25.0 μL。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸5 min。反應(yīng)完成后，取擴增pedA 基因片段5 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 對目的片段pedA 基因進行膠回收后與pMD19-T 載體連接， 構(gòu)建克隆載體pMD19-TpedA 并轉(zhuǎn)入E.coli DH5α 感受態(tài)細胞，選取陽性克隆接種于含氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定。

1.3.2 表達載體pET-32a-pedA 構(gòu)建提取重組質(zhì)粒pMD19-T-pedA 后與表達載體pET-32a（+）同時用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ、Hind III 進行酶切，用T4 DNA 連接酶對回收的pedA 片段和pET-32a（+）酶切產(chǎn)物進行連接， 連接體系如下：4.0 μL 回收的pedA 片段，2.0 μL pET-32a（+）載體酶切回收產(chǎn)物，1.0 μL 10×DNA 連接緩沖液，1.0 μL T4 DNA 連接酶（3 U/μL），2.0 μL ddH2O，總體系為10.0 μL。連接體系于4 ℃過夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞。 挑取E.coli BL21（DE3）單菌落接種于含氨芐青霉素 （終質(zhì)量濃度100 μg/mL）的LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)， 提取重組質(zhì)粒pET-32apedA 進行雙酶切鑒定。

1.3.3 重組菌的誘導(dǎo)表達將含有陽性質(zhì)粒pET-32a-pedA 的重組菌接種于100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入100 μL 異丙基硫代半乳糖苷（240 mg/mL），25 ℃過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)完成的菌液于7 000 r/min 離心15 min后棄上清液，用生理鹽水重懸菌體，重復(fù)2 次。 通過超聲波細胞破碎儀破碎菌體， 于12 000 r/min 離心15 min，分離上清液和沉淀，上清液用0.22 μm 的濾膜過濾，上清液變性后進行檢測。

1.3.4 成功表達的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1純化將2 mL Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂裝入Ni-NTA 預(yù)裝柱， 結(jié)合/洗脫緩沖液平衡柱子。 取5 mL結(jié)合/洗脫緩沖液與上清液混勻，裝入已添加填料的柱子，蛋白質(zhì)與填料于4 ℃過夜結(jié)合。2 倍柱體積的結(jié)合/洗脫緩沖液清洗柱子，用洗脫緩沖液洗脫帶有His-tag 的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1。 純化后的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 用SDS-PAGE 檢測純化情況并采用BCA 法檢測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.5 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的Western blot 方法鑒定以小鼠抗His-tag 單克隆抗體為一抗，工作濃度1∶6 000，山羊抗小鼠Ig G-HRP 為二抗，工作濃度1∶5 000。 純化的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 經(jīng)SDS-PAGE 檢測后切下相應(yīng)位置的PAGE 膠，進行轉(zhuǎn)膜。 37 ℃封閉4 h，用TBST 洗滌，一抗4 ℃孵育16 h 后TBST 洗滌， 二抗孵育2 h，TBST 洗膜后進行顯影。

1.3.6 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的活性鑒定通過雙層平板法鑒定乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1的蛋白質(zhì)活性，并以洗脫緩沖液各組分作為對照。

1.3.7 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 理化特性以1×106CFU/mL 的金黃色葡萄球菌懸液為指示菌， 將純化的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的pH調(diào)至2、4、6、8、10、12， 檢測不同pH 下的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌抑菌效果。乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在40、60、80、100、121 ℃處理20 min，檢測不同溫度下乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌抑菌效果。 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 用過氧化氫酶、 胃蛋白酶、胰蛋白酶（終質(zhì)量濃度均為20 mg/mL）于37 ℃處理2 h，之后于80 ℃水浴30 min 將酶滅活，檢測不同酶處理對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響。 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 經(jīng)紫外線照射0、2、4、6、8、10 h 來檢測其對紫外線的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌R-4 細菌素pedA 基因的克隆和表達載體構(gòu)建

如圖1 所示，將提取的乳酸片球菌R-4 基因作為模板，用特異性引物P.P-F 和P.P-R 擴增出序列長度為186 bp 的目的基因，與預(yù)期條帶大小相符。

圖1 pedA 基因片段PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of pedA gene fragment

目的條帶純化后與克隆載體pMD19-T 過夜連接，將重組質(zhì)粒pMD19-T-pedA 用限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ和Hind III 雙酶切，結(jié)果見圖2。 在2 600 bp和186 bp 處獲得2 條條帶，與克隆載體和乳酸片球菌R-4 細菌素pedA 基因大小相符， 表明pedA 基因與載體pMD19-T 成功連接并轉(zhuǎn)入到E.coli DH5α感受態(tài)細胞。

圖2 重組pMD19-T-pedA 質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD19-TpedA by restriction enzyme digestion

回收純化pedA 基因與pET-32a（+）進行連接后， 將重組質(zhì)粒pET-32a-pedA 經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶SacⅠ和Hind III 雙酶切，結(jié)果見圖3。在5 900 bp和186 bp 處獲得2 條條帶， 與表達載體pET-32a（+）和pedA 基因大小相符，表明目的基因pedA 與表達載體pET-32a（+）連接成功。

圖3 重組質(zhì)粒pET-32a-pedA 的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32apedA by restriction enzyme digestion

2.2 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的誘導(dǎo)表達和分離純化

將pET-32a（+）轉(zhuǎn)入E.coil BL21（DE3）感受態(tài)細胞作為空載體， 與含重組質(zhì)粒pET-32a-pedA 的E.coil BL21（DE3）細胞形成對照，用IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)，SDS-PAGE 電泳結(jié)果見圖4。 pET-32a-pedA 表達相對分子質(zhì)量26 000 的蛋白質(zhì)條帶，而pET-32a（+）表達的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為21 000，表明乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 成功表達。

圖4 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis results of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

帶有His-tag 的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1經(jīng)Ni-NTA 柱純化后的SDS-PAGE 結(jié)果見圖5。 在相對分子質(zhì)量26 000 處出現(xiàn)單一條帶，表明乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 純化效果良好。通過BCA 法測得第一次洗脫的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.245 mg/mL。

圖5 純化后的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的SDSPAGE 電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of purified Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的Western blot結(jié)果見圖6。 在相對分子質(zhì)量26 000 處顯影并出現(xiàn)單一條帶， 表明所純化出來的蛋白質(zhì)為帶His-tag的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1。

圖6 純化后乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的Western blot鑒定Fig.6 Identification of purified Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1 by western blot

將乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 以及洗脫緩沖液各組分進行抑菌試驗，結(jié)果見圖7。純化后含洗脫緩沖液的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 和250 mmol/L 咪唑同樣具有抑菌效果。將純化后含洗脫緩沖液的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 和洗脫緩沖液各組分梯度透析后進行抑菌試驗，結(jié)果見圖8。透析后的咪唑失去抑菌效果，而乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 通過透析除去咪唑等洗脫緩沖液成分后仍具有抑菌效果， 表明乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1具有蛋白質(zhì)活性。

圖7 純化后乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 及各組分的抑菌作用Fig.7 Antibacterial activity of purified Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1 and its components

圖8 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 和各組分透析后的抑菌作用Fig.8 Antibacterial activity of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA -1 and its components after dialysis

2.3 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 理化特性分析

2.3.1 溫度對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響如圖9 所示， 未處理的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.4 mm。 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在40～100 ℃處理20 min 后仍顯示出良好的抑菌作用，菌抑圈直徑在14.7～15.6 mm；121 ℃處理20 min 后抑菌圈直徑仍有14.1 mm，表明乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 具有耐熱性。

圖9 溫度對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響Fig.9 Effect of temperatures on the antibacterial effect of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

2.3.2 pH 對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響如圖10 所示，pH 8 對乳酸片球菌R-4細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為15.3 mm，在pH 2 時乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到16.5 mm。 在pH 4～6 時抑菌圈直徑雖然逐步下降，但仍具有較高的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為16.0 mm 和15.7 mm，比pH 8 的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌作用略強。pH 10 和pH 12 比pH 8 時乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果明顯降低， 抑菌圈直徑分別為14.6 mm 和14.0 mm。 這表明乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 具有較好的耐酸性，對堿性環(huán)境較為敏感。

圖10 pH 對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響Fig.10 Effect of pH environments on the antibacterial effect of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

2.3.3 酶種類對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響如圖11 所示， 未處理的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為15.3 mm， 經(jīng)胰蛋白酶和胃蛋白酶處理的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 失去抑菌作用，經(jīng)過氧化氫酶處理的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 仍然顯示出較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為14.9 mm，表明胃蛋白酶和胰蛋白酶可能分解乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1，而過氧化氫酶對其沒有影響。

圖11 酶種類對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響Fig.11 Effect of enzymes on the antibacterial effect of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

2.3.4 紫外線照射時間對乳酸片球菌R-4細菌素PA-1 抑菌效果的影響如圖12 所示，未照射紫外線的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為15.4 mm，經(jīng)2～10 h 紫外線照射后仍具有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為15.1～15.8 mm，表明紫外線照射對其抑菌效果幾乎沒有影響，乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 對紫外線不敏感。

圖12 紫外線照射時間對乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 抑菌效果的影響Fig.12 Effect of different UV irradiation times on the antibacterial effect of Pediococcus acidilactici R-4 bacteriocin PA-1

3 結(jié) 語

pET-32a（+）作為優(yōu)秀的表達載體，其Lac 基因僅在經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后才會進行表達， 有利于表達的進行。pET-32a（+）在N 端含有His-tag，有利于表達后利用His-tag 經(jīng)Ni-NTA 柱進行蛋白質(zhì)純化。 作者在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功表達相對分子質(zhì)量26 000 的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1， 并用Ni-NTA 柱純化出乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1，經(jīng)Western blot 鑒定為乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1，為后續(xù)試驗提供了較高純度的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1。

李亞玲報道分離純化后的乳酸片球菌細菌素在121 ℃處理20 min 后抑菌圈直徑為10.26 mm[21]，本研究所表達純化的乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1經(jīng)121 ℃處理20 min 后抑菌圈直徑為14.1 mm，有明顯提高，可能是因為乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 質(zhì)量濃度更高。乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1經(jīng)40～100 ℃處理20 min 后表現(xiàn)出較好的抑菌效果并基本保持穩(wěn)定， 抑菌圈直徑為15.6～14.7 mm ，表明具有較好的耐高溫特性， 與李亞玲的結(jié)論相似。食品制作過程中常用的巴斯德高溫滅菌為60～80 ℃，因此乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 作為食品添加劑與食品一同高溫滅菌后仍能保持抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)， 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在pH 2時抑菌效果最好，pH 4～6 則相對穩(wěn)定， 堿性環(huán)境中抑菌效果開始下降。 這與高兆建等報道發(fā)酵乳桿菌細菌素在pH 2～6 有較好的穩(wěn)定性，在pH＞6 時抑菌作用開始降低基本一致[22]。 相比于已經(jīng)商業(yè)化的乳酸鏈球菌素，乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在酸性食品中有較好抑菌效果。 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 經(jīng)紫外照射不會影響其抑菌活性， 含有乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的食品適當(dāng)存放在紫外線照射環(huán)境中，可能起到雙重殺菌作用。 乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 經(jīng)蛋白酶處理后失去抑菌活性，與陸洲等報道分離得到的植物乳桿菌細菌素在5 mg/mL 的胃蛋白酶和胰蛋白酶處理2 h 后完全失去抑菌作用的結(jié)果一致[23]。 因此在食用含乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 的食品后，乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在胃部被消化失活， 不會進入腸道而影響腸道菌群。 基于以上性質(zhì)，乳酸片球菌R-4 細菌素PA-1 在抑制食品病原菌以及食品保存方面都具有較為廣闊的應(yīng)用前景。