范力藝， 范群艷， 林佳馨， 胡嘉淼， 張 怡*

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002; 2.廈門燕之屋絲濃食品有限公司， 福建 廈門 360000；3.中糧生物科技股份有限公司，北京 102200）

燕窩是由鳥類雨燕科（Apodidae）若干種金絲燕的唾液腺分泌物及絨羽等混合物筑就的巢窩，為我國傳統(tǒng)名貴食材之一[1]。 燕窩以蛋白質(zhì)、碳水化合物和氨基酸為主要成分，其中必需氨基酸含量約占總氨基酸的50%，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[2]。 燕窩具有止咳化痰、潤肺生津、養(yǎng)胃補(bǔ)脾、抗氧化、延緩衰老等保健功效[2-4]。 此外，燕窩還可提高機(jī)體各項(xiàng)免疫機(jī)能，以對特異性及非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)最為顯著[5]。 現(xiàn)代社會崇尚營養(yǎng)健康且便捷安全的飲食模式，燕窩尤其是即食燕窩罐頭制品的市場需求量隨之增長。 由于燕窩罐頭工序冗長，包括挑揀燕毛、汽蒸燕窩、蒸煮冰糖、灌裝糖液等步驟，因此在復(fù)雜的加工過程中易被嗜熱菌污染，且燕窩罐頭pH 為6，水分活度Aw＞0.85， 屬于低酸性罐頭 （LACF），而LACF 的殺菌一直是食品殺菌的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

耐高溫微生物俗稱嗜熱菌， 分布于高溫區(qū)域，如溫泉、火山口、日照充沛的土壤表層、工廠高溫廢水排放地帶等， 大部分菌落的最適生長溫度為50～60 ℃[6]。嗜熱菌常見于青豆、蘑菇、蘆筍、肉類等低酸性罐頭，是引起低酸性食品罐頭腐敗變質(zhì)的典型平酸菌之一。 在低酸性罐頭原材料與加工鏈各個(gè)環(huán)節(jié)中，低濃度嗜熱菌繁殖迅速，易造成微生物污染。 且多數(shù)嗜熱桿菌能產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的耐熱芽孢，可抵御巴氏殺菌， 有的甚至能經(jīng)受超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）而存活[7-8]。 法國針對高溫?zé)崽幚砉揞^食品變質(zhì)原因的調(diào)查結(jié)果表明，嗜熱菌是絕大部分變質(zhì)罐頭產(chǎn)品的罪魁禍?zhǔn)住?有數(shù)據(jù)顯示，所有污染菌種中熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica）、地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、桿 菌 屬（Thermoanaero bacterium）為主要污染菌，分別占36%、35%和10%，還有9%的罐頭變質(zhì)產(chǎn)品被芽孢桿菌屬（Bacillus）污染[9]。

嗜熱菌的存在會引起罐頭內(nèi)容物感官特性的變化，如湯汁變渾濁、出現(xiàn)酸臭味等[10]，不僅影響產(chǎn)品品質(zhì)及安全性，還將失去食用價(jià)值，削弱在高溫環(huán)境下儲存的可行性，給企業(yè)帶來不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失[11]。燕窩罐頭成本高昂，難以進(jìn)行大量的成品檢測。雖然121 ℃滅菌處理30 min 以上可以使得燕窩罐頭免于嗜熱菌腐敗，但燕窩品質(zhì)往往無法得到保證。

因此，需要更好地了解嗜熱菌及其在制罐工業(yè)加工生產(chǎn)線上的來源，以確保更好地控制制罐衛(wèi)生條件。 微生物一般可通過內(nèi)源性污染和外源性污染的渠道對食品造成污染。 諸多資料顯示，嗜熱菌污染可能源于原料或者生產(chǎn)線，嗜熱桿菌可附著于乳品加工機(jī)械的不銹鋼表面形成生物膜并在奶垢層中繁殖[12]；經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)了午餐肉罐頭酸敗主要由于嗜熱脂肪芽孢桿菌污染水源、設(shè)備等外環(huán)境介質(zhì)所致[13]；平酸和硫化物嗜熱菌以及腐敗厭氧嗜中溫菌都能通過原料污染從而引起整個(gè)玉米罐頭腐敗變質(zhì)[14]。

對燕窩的研究較多關(guān)注其生物活性及生理功能，缺乏對其微生物安全方面的探討，更鮮見針對嗜熱菌污染造成燕窩罐頭產(chǎn)品腐敗的相關(guān)報(bào)道，因此有必要對燕窩罐頭中菌群結(jié)構(gòu)開展研究，研究燕窩罐頭中嗜熱微生物的來源。 作者基于16S rRNA測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法研究燕窩罐頭生產(chǎn)線上的微生物分布情況，分析優(yōu)勢菌；對比分析原料、不同生產(chǎn)工序以及終產(chǎn)品的微生物群系構(gòu)成的異同；揭示燕窩罐頭中腐敗微生物污染來源和關(guān)鍵工序，旨在為燕窩罐頭的生產(chǎn)質(zhì)量控制和衛(wèi)生監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

燕窩樣本：來自廈門一家燕窩有限公司，生產(chǎn)燕窩罐頭的大致流程（含采樣點(diǎn)標(biāo)記）見圖1。 對同一燕窩罐頭生產(chǎn)線的3 個(gè)批次進(jìn)行采樣（每個(gè)批次都在同一組條件下進(jìn)行），具體步驟為：在同一批次中的每處采樣點(diǎn)（如干燕窩原料）重復(fù)采樣5 次，再將3 個(gè)批次的樣本均勻混合，代表本研究的一個(gè)樣本 （如YW1）。 由此得到5 個(gè)樣本， 依次編號為YW1、YW2、YW3、YW4、YW5，作為本試驗(yàn)的研究對象。 所有工序車間按照食品車間沉降菌標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 16294—2010）執(zhí)行，所有樣品取樣后放入無菌袋中密封保存，樣本情況見表1。

表1 樣本情況說明Table 1 Description of samples

1.2 儀器與設(shè)備

E.Z.N.A.?soil 試劑盒：美國Omega Bio-Tek 公司；0.4 uL FastPfu 聚合酶： 中國TransGen 公司；引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）：上海生工生物工程公司；2 g/dL 瓊脂糖：西班牙Biowest；PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集在燕窩罐頭生產(chǎn)線上的5 處地點(diǎn)分別采集樣本， 編號為YW1、YW2、YW3、YW4、YW5，并注明來源。

1.3.2 細(xì)菌DNA 提取采用E.Z.N.A.?soil 試劑盒提取樣本的微生物基因組DNA，具體步驟見試劑盒說明。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增以基因組DNA 為模板進(jìn)行16S rRNA 基因序列擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性（95 ℃、3 min）、變性（95 ℃、30 s）、退火（55 ℃、30 s）、 延伸（72 ℃、30 s）、再延伸（72 ℃、10 min）。 擴(kuò)增整個(gè)體系為20 μL，包括：10 ng DNA 模板，4 μL 5×FastPfu緩 沖 液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引 物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶。

1.3.4 2 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳用2 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作如下：將瓊脂糖粉、TAE 電泳緩沖液、 核酸染料于錐形瓶中加熱融化；擺好梳子，待膠體冷卻到約60 ℃時(shí)倒膠，待膠體凝固后拿掉梳子，形成膠孔，把膠板放進(jìn)電泳槽，再緩慢傾注TAE 緩沖液直到液面在凝膠上方1～2 mm；混合樣品和上樣緩沖液后點(diǎn)樣于膠孔；連接電源進(jìn)行電泳，DNA 跑向正極， 觀察到條帶至下邊緣1 cm 時(shí)停止通電； 取出凝膠在成像系統(tǒng)下觀察拍攝。

1.3.5 Illumina Miseq 測序?qū)z測達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程公司， 使用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺對其測序。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理序列以97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，在此過程中去除單序列與嵌合體。 運(yùn)用RDP classifier 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，與Silva 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對， 并采用R 軟件聚類PCA 分析不同組分的關(guān)聯(lián)度。

1.3.7 傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)嗜熱菌使用AFNORCNERNA 標(biāo)準(zhǔn)[9]去重新激活樣品中的芽孢，每10 g樣品與100 mL 的錳鹽牛肉湯培養(yǎng)基置于錐形瓶中，分別放置于37 ℃和55 ℃下，在無氧（石蠟封口）和有氧條件下培養(yǎng)7 d， 然后搖勻并吸取錐形瓶中液體0.1 mL 在錳鹽瓊脂培養(yǎng)基上，置于相同溫度與相同氧氣下培養(yǎng)。 然后用十倍稀釋法，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小進(jìn)行單菌落挑取，在錳鹽培養(yǎng)基上劃線分離，多次分離單菌落用于分子生物學(xué)鑒定。

1.3.8 鑒定分離出的單細(xì)菌DNA 提取及16S rDNA 測序分析。 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒對SK8255 進(jìn)行DNA 提取， 將提取的16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 引物7F1540R（CAGAGTTTGATC CTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA）和27F1492R（AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGA CTT）。 反應(yīng)過程為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最終冷卻至4℃，擴(kuò)增結(jié)果再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴(kuò)增效果，若出現(xiàn)1.5 kb 的條帶，則證明擴(kuò)增出了16S rDNA 序列。 將擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣分析中的Chao1 和ACE 指數(shù)表示群落的豐度，Shannon 和Simpson 指數(shù)表示群落的多樣化[15]。 稀釋曲線（豐富度曲線）用于初步評估微生物多樣化分析中的測序數(shù)據(jù)量是否代表全部類群和物種的豐富性。 本研究中5 個(gè)采樣點(diǎn)的稀釋曲線見圖2。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

圖2 中橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣本隨機(jī)抽取的序列數(shù)， 縱坐標(biāo)表示測序深度指數(shù)observed species，即在測序深度下的OTU 數(shù)量，也就是物種數(shù)量。 樣本曲線的平緩程度反映了測序深度對于觀測樣本多樣性的影響大小。 由圖2 可知，在隨機(jī)抽取的序列數(shù)約3 000 處，5 條樣本曲線均趨于平坦，表明此時(shí)測序數(shù)據(jù)量已趨于飽和，測序深度可基本涉及樣本中的所有物種，即使增加測序數(shù)據(jù)也不能檢測到更多的OTU 單元。 故本研究的測序深度滿足要求，反映了樣本的完整菌群構(gòu)成，可用于數(shù)據(jù)分析。

圖3 （a） 表明在不同生產(chǎn)線不同工序中的Chao1 指數(shù)都存在顯著性，其中YW1、YW2、YW3 的Chao1 指數(shù)顯著增加， 表明其微生物豐富度顯著增加，這說明燕窩在汽蒸過程存在人員代入其他微生物的隱患；YW2、YW3、YW4 的Chao1 指數(shù)顯著下降，這可能由于冰糖蒸煮過程部分非耐熱微生物死亡降解； 而YW5 樣品是燕窩和冰糖最終混合的產(chǎn)品，因此有著最高的豐富度。 圖3（b）中的Shannon指數(shù)只有燕窩相關(guān)工序的YW1、YW2、YW3 樣品顯著增加，這表明YW3 樣品有著更好的均勻度，推測是汽蒸過程只降低了優(yōu)勢菌的含量，導(dǎo)致均勻度上升； 而燕窩原料在本身的環(huán)境中存在明顯優(yōu)勢菌，導(dǎo)致YW1 樣本的均一性較差， 因此Shannon 指數(shù)較低。

圖3 Alpha 多樣性分析Fig.3 Alpha diversity analysis

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 微生物群落豐度分布微生物環(huán)境是一個(gè)大型生態(tài)生物群落， 有著不同豐度的各類菌屬，每個(gè)菌屬的微生物種類和豐度因生境的不同而異。 這樣一個(gè)優(yōu)勢菌屬和低豐度菌屬的組成便稱為生境所具有群落結(jié)構(gòu)。 因此，在對物種多樣性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對燕窩罐頭原料與不同生產(chǎn)工序中的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。 燕窩原料與不同生產(chǎn)工序中微生物群落（門水平、屬水平）豐度分布情況見圖4。

圖4 微生物群落豐度分布圖Fig.4 Abundance distribution of microbial community

優(yōu)勢菌是指在一個(gè)菌群中占主導(dǎo)地位的菌。 從圖4（a）可知，在門分類水平中，Proteobacteria（變形菌門） 在5 份樣本中占據(jù)絕對優(yōu)勢地位， 其次為Deinococcus-Thermus （異常球菌-棲熱菌門）和Firmicutes （厚壁菌門）。 其中Deinococcus-Thermus的含量在燕窩汽蒸后（YW3 處）突增，代表這類微生物有較強(qiáng)的熱抵抗能力， 因此在汽蒸后得以生存，從而在菌群中占據(jù)更大的比例。 異常球菌-棲熱菌門中的水生棲熱菌（Thermus aquaticus）最早在美國黃石公園被發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)時(shí)經(jīng)檢測為一種極端嗜熱細(xì)菌，能在70 ℃下生長，該特性合理解釋了圖4 的突增現(xiàn)象[16]。 水生棲熱菌中提取出的Taq DNA 聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于PCR。 圖4（b）反映了屬分類水平中Acinetobacter （不動桿菌屬）、Ochrobactrum（蒼白桿菌屬）、Kluyvera（克呂沃爾氏菌屬）在群落構(gòu)成中占比較大，在全部樣本中綜合優(yōu)勢程度位列前三，均隸屬于變形菌門。

2.2.2 物種相對豐度聚類熱圖圖5 的物種豐度聚類熱圖直觀地展示了各樣本在屬分類水平上微生物群落的變化情況。 各樣本微生物群落在屬水平熱圖聚類成功， 且各屬細(xì)菌在5 個(gè)樣本中存在差異。YW2、YW4、YW5（冰糖相關(guān)工序及灌裝后產(chǎn)品）色塊構(gòu)成差異較小， 有相似的微生物群落構(gòu)成，YW1、YW3（燕窩相關(guān)工序）有相似的微生物群落構(gòu)成。 Acinetobacter 在YW1、YW3 中為優(yōu)勢菌屬，在YW2、YW4、YW5 中為非優(yōu)勢菌屬，這類菌屬為變形菌門， 是所有樣本屬水平微生物中的第一優(yōu)勢菌屬。 廣泛分布于土壤、山洞、水池等地，容易在潮濕的環(huán)境中生活，是條件致病菌，可造成免疫功能低下的機(jī)體皮膚、傷口、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等的感染，特別是呼吸道感染，還可能伴有咳嗽、發(fā)燒、胸痛等不良反應(yīng)[17]。 該菌屬中的鮑曼不動桿菌是醫(yī)院中感染重癥患者的典型病原菌，其多重耐藥為臨床防治帶來極大的難度[18-19]，故有關(guān)Acinetobacter 的微生物污染問題應(yīng)予以高度重視。 Ochrobactrum 和Kluyvera 在YW2、YW4、YW5 中 為 優(yōu) 勢 菌 屬，在YW1、YW3 中為非優(yōu)勢菌屬。 Ochrobactrum 屬于革蘭氏陰性菌，來源于動植物、水源、土壤等環(huán)境，是人類常見病原菌，有潛在的感染可能[20]。 有報(bào)道指出，人蒼白桿菌與布魯氏菌屬有著類似的生物學(xué)特性，在免疫、遺傳學(xué)方面具有高度關(guān)聯(lián)性，二者可相互交叉凝集，且臨床表現(xiàn)無差別，因此常引起鑒別和診斷上的失誤[21]。 Kluyvera 多在腸道、呼吸道、泌尿道標(biāo)本中檢出，是一種與人類腹瀉緊密聯(lián)系的條件致病菌，有些會使生物模型發(fā)生病變，且這類微生物具有廣泛的抗藥范圍，一經(jīng)感染將給治療造成困難[22-23]。

圖5 微生物群落豐度聚類熱圖（屬水平）Fig.5 Clustering heat map of microbial community abundance（genus level）

2.3 PCA 聚類分析

PCA 聚類分析（即主成分分析）是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，利用PCA 圖可進(jìn)一步得知YW1、YW2、YW3、YW4 和YW5 樣本之間微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)程度，見圖6。在坐標(biāo)圖上距離越近的樣本，物種組成相似性越大。

圖6 微生物群落PCA 圖Fig.6 PCA map of microbial community

圖7 培養(yǎng)分離出的細(xì)菌繪制發(fā)育樹Fig.7 A developmental tree drawn by culturing isolated bacteria

如圖6 所示，2 個(gè)主成分可反映樣本全部信息的96.3%（PC1 貢獻(xiàn)率86.35%，PC2 貢獻(xiàn)率9.95%），表明數(shù)據(jù)的提取較完全，且數(shù)據(jù)有很強(qiáng)的代表性。 5個(gè)樣本組內(nèi)，YW2、YW4、YW5 這3 個(gè)樣本之間的距離較近，聚集性較好；而YW1 與YW3 之間的距離較遠(yuǎn)，較為分散，主要體現(xiàn)在PC2 成分上。 這說明冰糖原料、蒸煮鍋糖液、灌裝后成品這3 個(gè)環(huán)節(jié)高度相關(guān)，微生物群落結(jié)構(gòu)相似；而燕窩原料、汽蒸后燕窩的微生物構(gòu)成存在較大差異，這應(yīng)該是由于燕窩在汽蒸過程，部分耐熱微生物在原料中占據(jù)更大的比例。 總體來看，冰糖組樣品（YW2、YW4、YW5）和燕窩組樣品 （YW1、YW3） 明顯分布于不一樣的區(qū)域，表示2 組樣品的物種組成差異較組內(nèi)大。

2.4 典型嗜熱菌分析

罐頭加工中的排氣工序會顯著降低罐內(nèi)氧含量，形成缺氧環(huán)境，這時(shí)厭氧菌和兼性厭氧菌成為主要腐敗菌。 另外，經(jīng)過熱殺菌處理，罐內(nèi)主要?dú)埩舻氖且仔纬裳挎咔夷蜔針O強(qiáng)的嗜熱菌。 表2 為燕窩原料與不同生產(chǎn)工序中典型嗜熱菌的檢測結(jié)果。

表2 典型嗜熱菌檢測情況Table 2 Detection of typical thermophilic bacteria

如表2 所示， 在YW2、YW4 和YW5 中檢出了Geobacillus（地芽孢桿菌屬）與Bacillus（芽孢桿菌屬），這是2 種常見的污染菌屬，具有高度耐熱性、嗜熱性，已被列為罐頭食品的典型腐敗菌屬[14]。在冰糖原料中檢出的2 類重要污染菌：Geobacillus 和Bacillus，并且蒸煮鍋的糖液和最終產(chǎn)品中也檢出相同的菌屬，這說明冰糖原料是燕窩罐頭的主要污染來源，并且與冰糖原料相關(guān)的YW4 工序也受到了冰糖的污染，因此需要對冰糖原料及相關(guān)工序進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)管。

地芽孢桿菌屬中G.stearothermophilus （嗜熱脂肪地芽孢桿菌） 是最常分離出的一種嗜熱桿菌，為表面粗糙、 呈米黃色的革蘭氏陽性菌。 它生長在pH≥5 的罐頭食品中，通過分解糖類產(chǎn)酸，發(fā)生平蓋酸敗。 在國標(biāo)中規(guī)定為濕熱滅菌生物指示劑，它可以用來證實(shí)滅菌設(shè)備的性能，評價(jià)滅菌程序有效性，檢驗(yàn)生產(chǎn)中的滅菌效果[24]。李雅麗等進(jìn)一步驗(yàn)證了嗜熱脂肪芽孢桿菌可作為低酸性飲料的殺菌指示劑[25]。芽孢桿菌屬對不良環(huán)境具有較強(qiáng)抗逆性，在土壤中最為常見，其中B.smithii（斯密氏芽孢桿菌）在罐頭食品、乳酪制品中分離獲得。 黃衛(wèi)強(qiáng)等在呼和浩特牛場地表土壤中分離鑒定出的優(yōu)勢菌有B.cereus（蠟狀芽孢桿菌）、B.thuringiensis（蘇云金芽孢桿菌）、B.licheniformis（地衣芽孢桿菌）[26]。B.cereus能夠產(chǎn)生多種毒素，易引起食物變質(zhì)和細(xì)菌性食物中毒，影響人體健康，所牽涉的食品種類極多。 有學(xué)者在天津某牧場奶樣中分離出較高比例的地衣芽孢桿菌，有些菌株還攜帶耐藥基因，可能增加生乳的安全隱患[27]。 B.subtilis（枯草芽孢桿菌）為一種靠鞭毛運(yùn)動的好氧菌，其菌落形態(tài)多變，能分解色氨酸， 影響植物體內(nèi)生長素吲哚乙酸的生物合成，可引起蘋果、梨等果樹的小葉病；能胨化牛奶，分解鮮乳中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生腐敗味。 有研究者在奶制品中分離出了B.subtilis，其菌株在孢子萌發(fā)后能在不銹鋼表面生長，這意味著該菌在工廠環(huán)境中有附著在器械設(shè)備的能力[28]。 可見這2 種菌都有較強(qiáng)的抗逆性與耐熱性能， 常從腐敗的罐頭中被分離出來，通常在121 ℃殺死1 個(gè)對數(shù)值的G.stearothermophilus需要3～6 min， 而殺死1 個(gè)對數(shù)值的B.smithii 需要1 min 左右， 因此這2 種耐熱性極強(qiáng)的菌屬可能會對燕窩罐頭食品安全造成極大威脅，而其中地芽孢桿菌屬可能產(chǎn)生的威脅更大[9]。 但是由于高通量測序通常只能精確到屬水平，因此需要通過分離培養(yǎng)的方法進(jìn)一步把嗜熱微生物鑒定到種水平。

2.5 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)

通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)后再進(jìn)行一代測序可以確定冰糖中活的嗜熱菌并且確定到種水平，其中一種為B.smithii（斯密氏芽孢桿菌），常從腐敗罐頭中將其分離出來；另外一種為Aeribacillus pallidus（蒼白芽孢桿菌）， 通常從奶粉中分離出來。 早期研究表明，Aeribacillus pallidus 可以在120～125 ℃存活30 min[29]。 從發(fā)育樹看，與罐頭常見腐敗微生物嗜熱脂肪地芽孢桿菌有很強(qiáng)的親緣關(guān)系， 同屬于Gebacillus；從序列親緣關(guān)系來看，蒼白芽孢桿菌這種微生物有著很強(qiáng)的熱抵抗能力，對后期燕窩罐頭殺菌造成了極大阻礙。

3 結(jié) 語

作者以燕窩罐頭2 種原料與3 個(gè)主要生產(chǎn)工序?yàn)檠芯繉ο螅?基于16S rRNA 高通量測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，對生產(chǎn)線樣品中的微生物多樣性展開了研究。 用稀釋曲線驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性，根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果將樣本大致分成2 組：燕窩相關(guān)生產(chǎn)工序（包括YW1 和YW3， 以下簡稱燕窩組樣本）、冰糖相關(guān)生產(chǎn)工序與灌裝后產(chǎn)品（包括YW2、YW4 和YW5，以下簡稱冰糖組樣本）。

綜合樣本微生物群落豐度分布圖和熱圖，發(fā)現(xiàn)2 組樣本間具有顯著差異， 冰糖組樣本內(nèi)差異較燕窩組更小，且冰糖組樣本之間有相同的優(yōu)勢菌和相似的微生物群落構(gòu)成，這說明污染的微生物也可能在冰糖相關(guān)工序中傳播。 PCA 聚類分析結(jié)果再次驗(yàn)證了冰糖相關(guān)生產(chǎn)工序與終產(chǎn)品樣本間密切的微生物聯(lián)系。從OTU 檢測結(jié)果可知，在冰糖原料、蒸煮鍋糖液、 灌裝后產(chǎn)品中均檢測出Gebacillus 和Bacillus， 而燕窩原料中沒發(fā)現(xiàn)這類嗜熱微生物，因此可推斷出，該生產(chǎn)線的污染微生物是由冰糖作為初始原料代入，而非燕窩原料或者其他生產(chǎn)工序中途代入，并且與冰糖相關(guān)的工序如熬制糖液也應(yīng)該作為關(guān)鍵工序進(jìn)行管控。 這源于冰糖特定的生產(chǎn)和銷售模式，它從結(jié)晶到包裝歷時(shí)較長，且多為人工操作，污染風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)大于機(jī)械自動化生產(chǎn)，一些車間衛(wèi)生條件較差，影響生產(chǎn)質(zhì)量，加之漫長的銷售周期，更促進(jìn)了細(xì)菌滋生，加重了冰糖污染[30]。 為了進(jìn)一步確認(rèn)冰糖中的嗜熱菌到種水平，將含有將冰糖嗜熱菌分離培養(yǎng)后通過測序技術(shù)確定了冰糖中的2種嗜熱菌， 分別為斯密氏芽孢桿菌與蒼白芽孢桿菌， 這2 種是高耐熱性的嗜熱菌， 尤其后者在130℃下也不一定能被完全殺死。 此前在糖中發(fā)現(xiàn)嗜熱脂肪地芽孢桿菌，并且發(fā)現(xiàn)受污染的砂糖是導(dǎo)致罐頭變質(zhì)的主要原因[31]。

嗜熱菌的高抗逆性以及在工序間的持久傳播性是個(gè)不容小覷的問題。 在實(shí)際生產(chǎn)過程中可以通過原料重點(diǎn)監(jiān)控篩選出不含嗜熱菌的供應(yīng)商進(jìn)行采購，或者可以通過預(yù)處理方式先降低原料中嗜熱菌總體數(shù)量，從而降低最后殺菌工序的強(qiáng)度，在保證燕窩罐頭品質(zhì)的同時(shí)，殺滅燕窩罐頭中的嗜熱微生物。

作者用16s rRNA 技術(shù)研究了燕窩生產(chǎn)線上的微生物，并且證實(shí)了冰糖原料與包括最終產(chǎn)品在內(nèi)的其他相關(guān)工序都攜帶嗜熱腐敗菌屬Geobacillus，從而確定冰糖原料的品質(zhì)是生產(chǎn)安全的關(guān)鍵控制點(diǎn)，而嗜熱菌可作為評估生產(chǎn)過程整體衛(wèi)生狀況是否良好的候選指標(biāo)。 采用該方法對不同批次的樣品進(jìn)行取樣，研究結(jié)果相互印證，具有較強(qiáng)的科學(xué)性。之前有報(bào)道表明茶葉與飲料等生產(chǎn)線上的微生物污染也采用了類似的取樣方法[32-33]，下一步可以在更多企業(yè)更多的生產(chǎn)線上收集微生物數(shù)據(jù)，以大數(shù)據(jù)的方式研究不同生產(chǎn)線上被污染情況，從而更加明確食品工廠微生物污染與其他因素之間的關(guān)聯(lián)性。 企業(yè)應(yīng)積極采取措施改善生產(chǎn)過程，如通過對生產(chǎn)線的適當(dāng)清洗、對原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高、對低酸性罐頭高溫穩(wěn)定性的測定以及實(shí)時(shí)監(jiān)測罐頭中嗜熱菌的變化等舉措[34-35]，以便更好地控制以嗜熱孢子為代表的污染菌群，從而提高食品安全性。