◎ 廖麗輝，侯艷飛，秦 捷，向忠平

（湖南省懷化市疾病預(yù)防控制中心，湖南 懷化 418000）

蠟樣芽胞桿菌在自然界中廣泛存在，很容易引起食物污染，食物受該菌產(chǎn)毒菌株污染后，從外觀、氣味上無(wú)顯著變化，食入后會(huì)引起食物中毒[1]。中毒后，還可引起敗血癥、心內(nèi)膜炎、創(chuàng)傷和肺部感染等疾病[2]。蠟樣芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中生化實(shí)驗(yàn)很相近，難以區(qū)分，而根狀生長(zhǎng)是區(qū)分二者的重要實(shí)驗(yàn)，而國(guó)標(biāo)中的“山谷狀生長(zhǎng)”和“根狀生長(zhǎng)”受很多因素影響，易導(dǎo)致主觀誤判，造成假陽(yáng)性。因此，精準(zhǔn)快速的檢測(cè)出蠟樣芽胞桿菌尤為重要。為了解不同條件下蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌根狀生長(zhǎng)檢測(cè)效果，本文選擇蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、實(shí)驗(yàn)室分離株，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nutrient Agar，NA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（Plate Count Agar，PCA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Tryptose Soya Agar，TSA）、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE），在單因素變量情況下，篩選根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

NA 培養(yǎng)基、PCA 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、TSA-YE培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯、血瓊脂平板均由青島海博技術(shù)有限公司生產(chǎn)；蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC 63306）、蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 10206）、實(shí)驗(yàn)室檢出的蠟樣芽胞桿菌30株，蕈狀芽孢桿菌20株。

NU-425-400 生物安全柜（Nuaire 公司）、GHP-9160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）、TP-3000E 電子天平（湘儀天平）、SQ510C 高壓滅菌器（雅馬拓科學(xué)）、HRCJ-2D 超凈工作臺(tái)（青島海爾）。

1.2 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將蠟樣芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株（簡(jiǎn)稱(chēng)LY 標(biāo)株）、蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株（簡(jiǎn)稱(chēng)XZ 標(biāo)株）、實(shí)驗(yàn)室蠟樣芽胞桿菌（簡(jiǎn)稱(chēng)LY）、實(shí)驗(yàn)室蕈狀芽胞桿菌（簡(jiǎn)稱(chēng)XZ）用腦心浸出液肉湯復(fù)蘇，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，后轉(zhuǎn)至血平板上，待培養(yǎng)過(guò)夜后做根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將經(jīng)過(guò)高壓滅菌的NA、PCA、TSA、TSA-YE培養(yǎng)基用移液管分別吸取9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、20 mL 加入無(wú)菌平板中，打開(kāi)蓋子讓其自然凝固，以減少瓊脂表面的水分。不同的量體現(xiàn)平板培養(yǎng)基的厚度有所不同。將所有平板置于37 ℃溫箱烘干5 h 后，使其在室溫條件下過(guò)夜干燥。本次實(shí)驗(yàn)中蕈狀標(biāo)株（XZ 標(biāo)株）為陽(yáng)性對(duì)照株，分別用一次性無(wú)菌接種針將復(fù)蘇好的菌株在上述不同量不同種類(lèi)的培養(yǎng)基上做根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，然后分別放置在30 ℃和37 ℃恒溫隔水式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h 時(shí)觀察培養(yǎng)狀態(tài)。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14 2014）[3]對(duì)根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判別：山谷狀生長(zhǎng)判為陰性，根狀生長(zhǎng)判為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 血平板培養(yǎng)結(jié)果

蠟樣芽胞標(biāo)準(zhǔn)菌株在血平板上出現(xiàn)較寬的溶血環(huán)，表現(xiàn)為完全透明的β 溶血現(xiàn)象，蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在血平板上溶血現(xiàn)象較蠟樣標(biāo)準(zhǔn)菌株略弱，而實(shí)驗(yàn)室蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌大部分出現(xiàn)完全透明溶血環(huán)，僅個(gè)別菌株表現(xiàn)為草綠色溶血現(xiàn)象。

2.2 20 h、24 h 觀察結(jié)果

經(jīng)20 h 觀察，僅37 ℃和30 ℃PCA 上的XZ 標(biāo)株與其中的3 株XZ 劃線邊緣略有毛刺，表現(xiàn)有輕微根狀現(xiàn)象，但其他平板上菌株劃線邊緣未見(jiàn)毛刺，僅沿接種線生長(zhǎng)，結(jié)果無(wú)法判別。經(jīng)24 h 觀察所有平板，30 ℃培養(yǎng)條件下，9 mL 的NA 和TSA 瓊脂平板上小部分XZ 劃線邊緣有微細(xì)且短的毛刺生長(zhǎng)，但不足以判別陰陽(yáng)性。而9 mL 和12 mL PCA 瓊脂平板上，經(jīng)24 h 培養(yǎng)的XZ 標(biāo)株可見(jiàn)微小毛刺，其他XZ 不夠明顯，LY 標(biāo)株基本上沿劃線生長(zhǎng)，未表現(xiàn)山谷狀生長(zhǎng)，9 mL PCA上30℃ 培養(yǎng)24 h的菌株生長(zhǎng)形態(tài)如圖1所示。

圖1 30 ℃ 24 h 9 mLPCA 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

2.3 48 h 觀察結(jié)果

經(jīng)48 h 觀察，30 ℃培養(yǎng)條件下，9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE 上大部分蕈狀可見(jiàn)粗短不整齊的邊緣，大部分蠟樣在上述平板上沿接種線生長(zhǎng)，邊緣有類(lèi)似不規(guī)整的波浪狀，擴(kuò)張于接種線外，故此時(shí)判定根狀生長(zhǎng)陰陽(yáng)性結(jié)果不夠準(zhǔn)確，但不同種類(lèi)平板中，PCA 和NA 效果更佳。37 ℃培養(yǎng)條件下，因菌落生長(zhǎng)快，整體偏大，導(dǎo)致蕈狀毛刺不明顯，且蠟樣芽胞桿菌山谷狀的形態(tài)不能顯現(xiàn)出來(lái)，容易誤判。30 ℃ PCA和NA 平板上的生長(zhǎng)特征如圖2 所示。

圖2 30 ℃ 48 h 9 mL PCA 和NA 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

2.4 72 h 觀察結(jié)果

經(jīng)72 h 觀察，30 ℃條件下9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE均可判定根狀生長(zhǎng)陰陽(yáng)性結(jié)果：LY及LY標(biāo)株呈山谷狀生長(zhǎng)，結(jié)果判陰性，XZ 和XZ 標(biāo)株呈根狀生長(zhǎng)，結(jié)果判陽(yáng)性。選取LY 標(biāo)株、XZ 標(biāo)株及其中一株食品LY 株，生長(zhǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖3、圖4、圖5、圖6。因其他平板均帶XZ 標(biāo)株、LY 標(biāo)株做對(duì)照，故不一一呈現(xiàn)。

圖3 30 ℃ 72 h PCA 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

圖4 30 ℃ 72 h NA 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

圖5 30 ℃ 72 h TSA-YE 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

圖6 30 ℃ 72 h TSA 上菌落生長(zhǎng)形態(tài)圖

經(jīng)觀察，瓊脂厚度越薄，同一種培養(yǎng)基根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)越容易區(qū)分。9 mL 和12 mL 的4 種不同種類(lèi)的平板結(jié)果表明，在PCA 平板、NA 平板、TSA 平板上30 株LY 均可明顯看到菌苔沿接種線擴(kuò)張生長(zhǎng)，且呈波浪紋，無(wú)細(xì)小毛刺，即呈現(xiàn)明顯山谷狀生長(zhǎng)現(xiàn)象，結(jié)果為陰性，20 株XZ 均可見(jiàn)豐富的毛須，且較LY的波浪狀更細(xì)更密集，樹(shù)根樣擴(kuò)展開(kāi)，呈現(xiàn)根狀生長(zhǎng)，結(jié)果為陽(yáng)性，生長(zhǎng)現(xiàn)象見(jiàn)圖3、圖4、圖5（右上角平板）。同時(shí)，LY標(biāo)株和XZ標(biāo)株均可判定結(jié)果。而TSA-YE上，30 株LY 均呈現(xiàn)山谷狀生長(zhǎng)，18 株XZ 判為根狀生長(zhǎng)，還有2 株XZ 根狀現(xiàn)象無(wú)法判別。

當(dāng)瓊脂量在15 mL 時(shí)，PCA 瓊脂上29 株LY 和18 株XZ 仍可判斷結(jié)果，NA 瓊脂上28 株LY 和19 株XZ 可判斷結(jié)果，TSA 瓊脂上27 株LY 和14 株XZ 可判斷結(jié)果，TSA-YE 瓊脂上24 株LY 和5 株蕈狀可判斷結(jié)果。

當(dāng)瓊脂量在18 mL 和20 mL 時(shí)，所有平板上菌苔均沿線擴(kuò)大，整體較粗，易影響結(jié)果判斷，PCA 瓊脂上15 株LY 和6 株XZ 結(jié)果比較明顯，NA 瓊脂上13 株LY 和5 株XZ 結(jié)果也可判別。在TSA 和TSA-YE上，18 mL 雖較20 mL 菌苔窄，但總體偏粗，均出現(xiàn)大鋸齒狀，導(dǎo)致XZ 和LY 邊緣生長(zhǎng)特征均不明顯，無(wú)法判別。

37 ℃培養(yǎng)條件下，菌株在劃線上因生長(zhǎng)過(guò)快而較粗大，會(huì)影響結(jié)果判斷，整體看來(lái)，LY 結(jié)果受影響較少，故不容易出現(xiàn)假陰性，但XZ 結(jié)果受瓊脂厚度影響較大，易造成假陽(yáng)性結(jié)果，且瓊脂量越多，即厚度越厚，假陽(yáng)性率越高。從不同種類(lèi)的瓊脂來(lái)看，PCA效果最佳。

3 結(jié)論與討論

蠟樣芽胞桿菌的繁殖體較為耐熱，加熱100 ℃20 min 可以被殺死，它產(chǎn)生的芽孢可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在并大量繁殖[4]，引起的中毒事件屢見(jiàn)不鮮，準(zhǔn)確快速地區(qū)分蠟樣和蕈狀的實(shí)驗(yàn)工作極其重要，從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)可以受培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)基厚度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等因素影響，尤其對(duì)于從事蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的新人員來(lái)說(shuō)有一定難度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受主觀影響，容易將蕈狀判為蠟樣，從而直接影響腸毒素等后續(xù)檢測(cè)工作，導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)。尤其在由蠟樣引起的食物中毒發(fā)生時(shí)，快速提高檢測(cè)能力，準(zhǔn)確查出致病因子是重中之重。受多因素影響，實(shí)際工作中蕈狀和蠟樣在MYP 平板上形態(tài)很相近，不具有典型菌落形態(tài)，且因蠟樣的動(dòng)力實(shí)驗(yàn)有些型別為陰性，故動(dòng)力實(shí)驗(yàn)并不能很好地區(qū)分蕈狀和蠟樣。根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)在區(qū)分二者上意義重大，本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)選取的實(shí)驗(yàn)株更具有代表性，為實(shí)驗(yàn)室提供一定的理論基礎(chǔ)。

近年來(lái)，蠟樣芽胞桿菌食物中毒比例較高，常見(jiàn)此菌檢出自米面、谷物、肉制品等富含碳水化合物的食品[5]。實(shí)驗(yàn)室可以選擇合適的平板，以提高工作效率。本次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了培養(yǎng)條件，由圖1 可見(jiàn)，經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，在PCA 平板上，LY 的山谷狀生長(zhǎng)及XZ的根狀生長(zhǎng)并不明顯，極個(gè)別可粗略判斷結(jié)果，在其他3 種培養(yǎng)基上，XZ 毛刺未長(zhǎng)出，且LY 沿線生長(zhǎng)，無(wú)山谷狀現(xiàn)象，可能與培養(yǎng)時(shí)間不夠，菌數(shù)達(dá)不到擴(kuò)展生長(zhǎng)量有關(guān)；經(jīng)48 h 后，PCA 平板優(yōu)勢(shì)顯現(xiàn)出來(lái)，尤其是XZ 毛須初形成，但與LY 的波狀紋相似，主觀判斷不肯定；經(jīng)72 h 后，菌落形態(tài)見(jiàn)圖3、圖4、圖5、圖6，經(jīng)觀察，XZ 的根狀現(xiàn)象和LY 的山谷狀能明顯區(qū)分，尤其XZ 根狀多而細(xì)長(zhǎng)，在平板厚度相同條件下，不同培養(yǎng)基PCA ＞NA ＞TSA ＞TSA-YE；由72 h培養(yǎng)的圖片顯示，同一平板不同量區(qū)別很大，但9 mL和12 mL 在PCA 和NA 上因僅3 mL 體積差，對(duì)厚度的改變不大，效果尚可，其中以9 mL 最明顯，平板厚度9 mL ＞12 mL ＞15 mL ＞18 mL ＞20 mL。因此，實(shí)驗(yàn)室在用根狀生長(zhǎng)區(qū)分蠟樣和蕈狀時(shí)，可傾注9 mL的PCA 經(jīng)干燥表面水分后在30 ℃培養(yǎng)72 h，非常容易區(qū)分根狀生長(zhǎng)和山谷狀生長(zhǎng)，且XZ 判為L(zhǎng)Y 的假陽(yáng)性率極低（20 株/20 株，0%），注意培養(yǎng)時(shí)間不能超過(guò)72 h，否則平板易干燥開(kāi)裂，不利于結(jié)果觀察。當(dāng)基層實(shí)驗(yàn)室未儲(chǔ)備PCA 時(shí)，可按照GB 4789.14 2014使用NA 平板，但培養(yǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)至72 h（國(guó)標(biāo)為24 ～48 h），且瓊脂的量控制在9 mL。當(dāng)儲(chǔ)備PCA 時(shí)，該實(shí)驗(yàn)可首選PCA，從而提高檢出率，降低假陽(yáng)性率，為蠟樣芽孢桿菌引起的食源性突發(fā)事件處置提供一定的參考。