鄒 昊， 田寒友， 白 京， 王 輝， 史宇璇， 喬曉玲*

(1.中國(guó)肉類(lèi)食品綜合研究中心，北京 100068；2.肉類(lèi)加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068)

基于菌株的生長(zhǎng)可被特定抗生素抑制的原理，微生物法是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)食品中抗生素殘留總量的方法[1]。其中，利用嗜熱脂肪地芽胞桿菌(Geobacillusstearothermophilus)對(duì)多種抗生素敏感[2-3]、繁殖速度快和產(chǎn)芽胞可長(zhǎng)期保藏等特點(diǎn)開(kāi)發(fā)的試管擴(kuò)散法已成為檢測(cè)鮮乳及其他動(dòng)物源性食品中抗生素殘留總量的標(biāo)準(zhǔn)方法[4-9]。現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法中，在制備芽胞懸液的過(guò)程中沒(méi)有將芽胞與營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞分離，而是通過(guò)熱水浴((80±2) ℃，10 min)的方式將營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞殺死[7]。這樣制備的芽胞懸液因含有死亡的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，主要存在以下兩個(gè)問(wèn)題：首先，因?yàn)槊看沃苽涞难堪麘乙褐袪I(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的數(shù)量都不固定，所以只能通過(guò)菌落計(jì)數(shù)的方式來(lái)確定芽胞的濃度，需要培養(yǎng)48 h，延長(zhǎng)了檢測(cè)管的制備時(shí)間[10]；其次，由死亡的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞分解產(chǎn)生的胞壁肽等物質(zhì)可誘導(dǎo)芽胞萌發(fā)，易導(dǎo)致檢測(cè)管在保藏過(guò)程中失效，縮短了檢測(cè)管的保質(zhì)期[11-12]。因此，在制備芽胞懸液的過(guò)程中，對(duì)芽胞進(jìn)行純化是很有必要的。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在相關(guān)研究中也介紹了芽胞純化方法，Georget等[13-21]通過(guò)反復(fù)離心并傾倒上清液的方式去除混懸液中的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞。Finley等[22-26]在離心法的基礎(chǔ)上加入了酶解和超聲等環(huán)節(jié)以提高芽胞純化效率。但這些方法或多或少都存在著制備時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣以及所需的儀器和試劑較多等問(wèn)題。本研究以嗜熱脂肪地芽胞桿菌為例，介紹了一種簡(jiǎn)單高效的芽胞純化方法，應(yīng)用此方法對(duì)其芽胞進(jìn)行純化后，通過(guò)鏡檢等方式從純化后芽胞懸液的純度，保藏2 a后芽胞懸液的質(zhì)量以及對(duì)其他芽胞桿菌芽胞的純化效果等方面對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，為芽胞純化方法的改進(jìn)，以及進(jìn)一步提高試管擴(kuò)散法對(duì)食品中抗生素殘留總量的檢測(cè)性能，縮短其制備時(shí)間，延長(zhǎng)其保質(zhì)期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 嗜熱脂肪地芽胞桿菌(GeobacillusstearothermophilusCICC 10425)、嗜熱脂肪地芽胞桿菌(GeobacillusstearothermophilusCICC 10392)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisCICC 20474)、枯草芽胞桿菌(BacillussubtilisCICC 20506)，由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 胰蛋白胨(LP0042)，英國(guó)OXOID公司；酵母提取物(212750)、瓊脂粉(214010)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(23400)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(213000)，美國(guó)BD公司；無(wú)水葡萄糖、無(wú)水磷酸氫二鉀、四水合氯化錳(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 離心機(jī)(SORVALL LYNX 4000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；電子天平(BSA822-CW，德國(guó)Sartorius公司)；pH計(jì)(PB-10， 德國(guó)Sartorius公司)；相差顯微鏡(PRIMO STAR，德國(guó)ZEISS公司)；顯微鏡彩色制冷CCD (ProgRes CF SCAN，德國(guó)JENOPTIK公司)；自然對(duì)流培養(yǎng)箱(BD260，德國(guó)BINDER公司)；多功能酶標(biāo)儀(Synergy H4，美國(guó)BioTek公司)；生物安全柜(AIRSTREAM ClassⅡ，新加坡ESCO公司)；全溫振蕩培養(yǎng)箱(THZ-C-1型，太倉(cāng)市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；加熱磁力攪拌器(85-2，上海司樂(lè)儀器有限公司)。

1.2 方法

本研究中與菌株接觸的培養(yǎng)基、化學(xué)試劑、耗材和器具等均經(jīng)過(guò)環(huán)氧乙烷或121 ℃，15 min的濕熱滅菌；涉及的操作，除離心、震蕩、磁力攪拌、培養(yǎng)、鏡檢和吸光度值檢測(cè)外，均在生物安全柜內(nèi)完成。

1.2.1 菌株的復(fù)壯 根據(jù)保藏中心提供的說(shuō)明書(shū)，先用100 μL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)的菌種凍干粉溶解，再轉(zhuǎn)移到5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，(55±0.1) ℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2代以恢復(fù)菌株的活力，0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 芽胞的培養(yǎng) 對(duì)Kim等[25]的芽胞培養(yǎng)方法進(jìn)行了改進(jìn)，培養(yǎng)溫度為(55±0.1) ℃，培養(yǎng)24 h后將平板倒置防止水分過(guò)度蒸發(fā)，培養(yǎng)5～7 d后，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)芽胞大量產(chǎn)生且成熟度滿足要求后，對(duì)芽胞進(jìn)行采集和純化。

1.2.3 芽胞的采集 吸取20 mL，0～4 ℃的蒸餾水至培養(yǎng)基表面，用L形玻璃棒將培養(yǎng)基表面的菌苔刮落，制成芽胞和營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的混懸液并轉(zhuǎn)移到離心瓶中。

1.2.4 芽胞的純化 將離心瓶放入振蕩培養(yǎng)箱中，0～4 ℃，180 r/min振蕩30 min，打散混懸液中粘連在一起的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和芽胞。然后根據(jù)本研究介紹的方法對(duì)混懸液中的芽胞進(jìn)行純化。①將離心瓶放入離心機(jī)中，0～4 ℃，690 g離心30 min。②將上清液傾倒干凈。③將離心瓶?jī)A斜，沿沒(méi)有沉淀的一側(cè)向離心瓶中緩慢加入200 mL，0～4 ℃的蒸餾水并放入磁力轉(zhuǎn)子。④將離心瓶放在磁力攪拌器上，緩慢提高轉(zhuǎn)速至600～1 200 r/min，通過(guò)使離心瓶中的蒸餾水形成的漩渦沖刷營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞沉淀層，讓營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞逐漸從沉淀層剝離并懸浮于水中。當(dāng)芽胞沉淀層開(kāi)始裸露時(shí)，緩慢降低轉(zhuǎn)速直至停止。在此過(guò)程中要保證芽胞沉淀層的完整。⑤將營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液傾倒干凈。⑥向離心瓶中加入200 mL，0～4 ℃的無(wú)菌蒸餾水，振蕩使所有沉淀物重新懸浮于水中。⑦重復(fù)步驟①～⑥直到芽胞純度達(dá)到要求。將制備好的芽胞懸液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，0～4 ℃避光保藏。

1.2.5 芽胞懸液純度檢測(cè) 首先將制備好的芽胞懸液離心(0～4 ℃，690 g，30 min)，觀察沉淀的分層情況，然后將其制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態(tài)和純度。

1.2.6 保藏2 a后芽胞懸液質(zhì)量檢測(cè) 將制備好的芽胞懸液在0～4 ℃的環(huán)境下避光保藏2 a后，取出制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態(tài)和純度。

1.2.7 芽胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)制備好的芽胞懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)褂妹笜?biāo)儀測(cè)量其在600 nm處的吸光度(optical density at 600 nm,OD600)值，每個(gè)稀釋梯度測(cè)量3次取算數(shù)平均值，選取OD600值在0～0.8之間的稀釋梯度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以O(shè)D600值為自變量，菌落數(shù)為應(yīng)變量,進(jìn)行線性回歸，建立基于芽胞懸液OD600值的芽胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 對(duì)其他芽胞桿菌芽胞的純化效果 使用本研究介紹的方法對(duì)嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20506)的芽胞進(jìn)行純化。將制備好的芽胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下(100×油鏡)觀察芽胞的狀態(tài)和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽胞的培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)5 d的培養(yǎng)，芽胞的成熟度如圖1所示，可見(jiàn)菌苔中大部分營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞已經(jīng)死亡且其中一部分已經(jīng)自溶分解成細(xì)胞碎屑，只有少量成熟的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞。絕大部分芽胞為游離的芽胞，只有個(gè)別已萌發(fā)的芽胞。根據(jù)樊佳等[27]介紹的芽胞成熟度鏡檢評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)芽胞成熟度為Ⅴ級(jí)，可以對(duì)芽胞進(jìn)行采集和純化。

圖1 培養(yǎng)5 d后芽胞的成熟度 Fig.1 The maturity of the endospores after 5 days of incubation

2.2 純化效果

將純化前的芽胞和營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的混懸液離心，所得的沉淀如圖2a所示，沉淀分為2層，上層呈米黃色為密度較小的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)胞碎屑，下層呈白灰色為密度較大的芽胞。將混懸液制成切片在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)如圖2e所示，純化前，混懸液中除了游離的芽胞外還混有很多營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和個(gè)別已萌發(fā)的芽胞。

第一次選擇性懸浮營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞后，對(duì)傾倒出去的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，所得的沉淀如圖2b所示，沉淀全部呈米黃色，且未見(jiàn)芽胞沉淀層。將營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)如圖2f所示，傾倒出去的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液中幾乎全部為營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞及細(xì)胞碎屑，只有個(gè)別游離的芽胞混在其中。

按照1.2.4中步驟①～⑥進(jìn)行1次純化后，對(duì)所得的混懸液進(jìn)行離心，所得的沉淀如圖2c所示，沉淀整體呈白灰色，頂端略帶黃色，幾乎看不到營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞沉淀層。將混懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)如圖2g所示，純化1次后的混懸液中大部分為游離的芽胞，但仍混有少量營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和已萌發(fā)的芽胞。與圖2e相比，盡管只進(jìn)行了1次純化，但是混懸液中的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)胞碎屑均已明顯減少。

重復(fù)步驟①～⑥ 6次后，芽胞純度已達(dá)到本研究要求。將制備的芽胞懸液離心，所得的沉淀如圖2d所示，可見(jiàn)沉淀全部呈白灰色，且未見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞沉淀層。將芽胞懸液制成切片，在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)如圖2h所示，純化后的芽胞懸液中幾乎全部為游離的芽胞，只有個(gè)別已萌發(fā)的芽胞混在其中，且未見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)胞碎屑。

綜上所述，本方法先通過(guò)離心使混懸液分層沉淀，再通過(guò)磁力攪拌的方式選擇性懸浮上層的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞并保證芽胞沉淀層的完整，可以高效地將混懸液中的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞與芽胞分離，純化后所得的芽胞懸液純度較高。

圖2 純化過(guò)程中混懸液的變化 Fig.2 The changes in the mixed suspension during the purification processa、b、c和d分別為純化前的混懸液、傾倒出去的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液、純化1次后的混懸液和純化后的芽胞懸液經(jīng)離心后所得的沉淀；e、f、g和h分別為a、b、c和d對(duì)應(yīng)的相差顯微鏡鏡檢圖a, b, c and d are the sediments from centrifuging the mixed suspension before purification, the vegetative cell suspension which were poured out, the mixed suspension after the first round of purification and the endospore suspension after purification; e, f, g and h are the phase contrast microscopic images of a, b, c and d

2.3 保藏2 a后芽胞懸液的質(zhì)量

保藏2 a后，芽胞懸液的質(zhì)量如圖3所示，此時(shí)懸液中大部分芽胞仍為游離的芽胞，只有少量已萌發(fā)的芽胞，說(shuō)明通過(guò)本方法制備的芽胞懸液，在保藏2 a后，仍具有較高的質(zhì)量。與圖2h相比，懸液中已萌發(fā)的芽胞數(shù)量有小幅增加。其原因可能如Kussell等[28-30]在其研究中發(fā)現(xiàn)的一樣，一些芽胞桿菌的芽胞具有隨機(jī)萌發(fā)的特性，即每隔一段時(shí)間，種群中就會(huì)有一小部分芽胞自然萌發(fā)以保證芽胞種群在沒(méi)有萌發(fā)誘導(dǎo)物質(zhì)存在但適宜生長(zhǎng)的環(huán)境下也可以正常萌發(fā)生長(zhǎng)。

圖3 保藏2 a后芽胞懸液的質(zhì)量 Fig.3 The quality of the endospore suspension after two years of storage

2.4 芽胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)芽胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。可見(jiàn)菌落數(shù)與OD600值之間有很好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.99)。再次說(shuō)明通過(guò)本方法制備的芽胞懸液純度較高，可用檢測(cè)其OD600值的方式來(lái)取代菌落計(jì)數(shù)法，對(duì)芽胞濃度進(jìn)行快速測(cè)定。

圖4 嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G. stearothermophilus CICC 10392)芽胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.4 The endospore concentration standard curve of G. stearothermophilus CICC 10392

2.5 對(duì)其他芽胞桿菌芽胞的純化效果

使用本方法制備的嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B.subtilisCICC 20506)的芽胞懸液如圖5所示，可見(jiàn)各懸液中幾乎全部為游離的芽胞，只有個(gè)別細(xì)胞碎屑混在其中且未見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和已萌發(fā)的芽胞。說(shuō)明本方法對(duì)其他芽胞桿菌的芽胞也有較好的純化效果。

圖5 對(duì)其他芽胞桿菌芽胞的純化效果 Fig.5 The purification effects on the other Bacillus spp.a、b和c分別為使用本方法制備的嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G. stearothermophilus CICC 10425)、枯草芽胞桿菌(B. subtilis CICC 20474)和枯草芽胞桿菌(B. subtilis CICC 20506)芽胞懸液的相差顯微鏡鏡檢圖a, b and c are the phase contrast microscopic images of G. stearothermophilus CICC 10425, B. subtilis CICC 20474 and B. subtilis CICC 20506 endospore suspension prepared by using the method that introduced in this study

2.6 不同純化方法的比較

相關(guān)研究中不同芽胞純化方法所需的操作、儀器、試劑和時(shí)間如表1所示，其中離心法是目前應(yīng)用最多的方法，盡管該方法操作簡(jiǎn)單，涉及的儀器和試劑較少，但是耗時(shí)最長(zhǎng)，大約需要4～14 d。如圖2a和2e所示，其原因在于，即使在離心力較低(690 g)的情況下，混懸液中死亡的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞、成熟的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和體積較大的細(xì)胞碎屑仍會(huì)與芽胞一起沉淀下來(lái)，只有那些體積較小的細(xì)胞碎屑會(huì)在離心后懸浮于上清液中。所以在使用離心法時(shí)，會(huì)在較長(zhǎng)的一段時(shí)間(4～14 d)內(nèi)反復(fù)對(duì)混懸液進(jìn)行離心，一方面，誘導(dǎo)成熟的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境下逐漸死亡，另一方面，使死亡的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞在自溶酶的作用下逐漸分解成體積較小的細(xì)胞碎屑，從而通過(guò)離心的方式將營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞與芽胞分離，達(dá)到純化芽胞的目的[14-17]。

Finley等[22-26]為了加快營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞分解成細(xì)胞碎屑的速度，在離心法的基礎(chǔ)上加入了酶解和超聲等環(huán)節(jié)。盡管這樣可以明顯縮短芽胞懸液的制備時(shí)間，但同時(shí)也增加了操作的復(fù)雜程度以及所需的儀器和試劑。此外，陳振民等[31-33]在其研究中發(fā)現(xiàn)，酶解過(guò)程中，在營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞破裂死亡并逐漸分解成細(xì)胞碎屑的同時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及細(xì)胞的酶解產(chǎn)物(胞壁肽等)可誘導(dǎo)周?chē)难堪劝l(fā)，說(shuō)明對(duì)混懸液進(jìn)行酶解可誘導(dǎo)部分游離的芽胞萌發(fā)，造成游離芽胞數(shù)量的減少。Berger等[34-37]在其研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)芽胞進(jìn)行超聲處理后，可在周?chē)h(huán)境中檢測(cè)到由芽胞核釋放的Ca2+和吡啶二羧酸(quinolinic acid, DPA)分子，同時(shí)芽胞衣外層的多種蛋白、糖肽、脂肪酸、脂酰甘油和糖脂也會(huì)隨之脫落；Gould等[38-40]發(fā)現(xiàn)當(dāng)芽胞衣的外層結(jié)構(gòu)被破壞后，其對(duì)多種酶、表面活性劑和化學(xué)殺菌劑的抗性大大減弱；Palaclos等[35]發(fā)現(xiàn)DPA的釋放可導(dǎo)致芽胞核的水合，促使芽胞萌發(fā)，且Setlow等[41-43]發(fā)現(xiàn)釋放到環(huán)境中的DPA分子可誘導(dǎo)周?chē)难堪劝l(fā)，說(shuō)明對(duì)混懸液進(jìn)行超聲也可誘導(dǎo)部分游離的芽胞萌發(fā)，造成游離芽胞數(shù)量的減少。

與其他方法相比，本方法不僅操作較簡(jiǎn)單，所需的儀器較少，不使用任何試劑且耗時(shí)更短。

表1 不同純化方法所需的操作、儀器、試劑和時(shí)間

3 討 論

在使用本方法對(duì)芽胞進(jìn)行純化的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，混懸液進(jìn)行離心時(shí)，若離心力過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致沉淀層過(guò)于緊實(shí)，在選擇性懸浮營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞不易被從沉淀層中剝離或沉淀層成塊脫落的現(xiàn)象；若離心力過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致沉淀層過(guò)于松散，在傾倒上清液時(shí)，部分沉淀層會(huì)隨水流一起被傾倒出去，且在選擇性懸浮營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞時(shí)，很難保證芽胞沉淀層的完整。純化2～3次后，會(huì)出現(xiàn)在傾倒出去的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞懸液中，游離芽胞的數(shù)量逐漸增多的現(xiàn)象，此時(shí)可適當(dāng)增加離心的時(shí)間，使沉淀層更為緊實(shí)，在選擇性懸浮營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞時(shí)，可以更好地保證芽胞沉淀層的完整，減少芽胞的流失。隨著純化次數(shù)的增加，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)離心后已看不到明顯的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞沉淀層，但鏡檢仍可觀察到少量營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)胞碎屑的現(xiàn)象，此時(shí)可通過(guò)將芽胞沉淀層表面的少量芽胞懸浮于水中并傾倒出去的方式去除剩余的少量營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞和細(xì)胞碎屑。

本研究介紹了一種簡(jiǎn)單高效的芽胞純化方法，以嗜熱脂肪地芽胞桿菌(G.stearothermophilusCICC 10392)為例，應(yīng)用此方法對(duì)其芽胞進(jìn)行純化后，通過(guò)鏡檢等方式從純化后芽胞懸液的純度、保藏2 a后芽胞懸液的質(zhì)量以及對(duì)其他芽胞桿菌芽胞的純化效果等方面對(duì)此方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)論如下：由于芽胞的密度大于營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，所以離心后，混懸液會(huì)分層沉淀，上層為營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞沉淀層，下層為芽胞沉淀層；通過(guò)磁力攪拌的方式選擇性懸浮上層的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞并保證芽胞沉淀層的完整，可以高效地將混懸液中的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞與芽胞分離，純化后，所得的芽胞懸液純度較高；通過(guò)本方法制備的芽胞懸液在保藏2 a后仍具有較高的質(zhì)量；通過(guò)本方法制備的芽胞懸液，可通過(guò)檢測(cè)其OD600值的方式快速測(cè)定其中芽胞的濃度；使用本方法對(duì)其他芽胞桿菌的芽胞進(jìn)行純化，所得的芽胞懸液純度較高；與其他純化方法相比，本方法不僅操作較簡(jiǎn)單，所需的儀器較少，不使用任何試劑且耗時(shí)更短。

本研究可以為芽胞純化方法的改進(jìn)以及進(jìn)一步提高試管擴(kuò)散法對(duì)食品中抗生素殘留總量的檢測(cè)性能，縮短其制備時(shí)間，延長(zhǎng)其保藏期方面提供參考。