王德成， 管仲瑩

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

下呼吸道感染是臨床常見的感染性疾病，具有較高的發(fā)病率和致死率。近年來(lái)，廣譜和超廣譜抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增加，加大了臨床治療難度，增加了醫(yī)療費(fèi)用[1]。下呼吸道感染致病菌的菌群分布主要以革蘭陰性桿菌為主，且多年來(lái)所占比例呈上升趨勢(shì)[2]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是最嚴(yán)重的院內(nèi)獲得性感染的病原菌之一[3]，由于抗菌藥物被過度使用及各種有創(chuàng)診療操作的廣泛開展，該菌多重耐藥現(xiàn)狀在世界范圍內(nèi)日趨嚴(yán)重[4]。研究銅綠假單胞菌的耐藥性有助于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，節(jié)約醫(yī)療資源。痰培養(yǎng)是診斷下呼吸道感染最重要的手段[5]。因此，通過痰培養(yǎng)研究下呼吸道致病菌的菌群分布及銅綠假單胞菌的耐藥性，有利于分析病原菌的分布特點(diǎn)，從而指導(dǎo)臨床用藥，為醫(yī)療衛(wèi)生部門提供有力的參考，具有非常重要的意義。本研究對(duì)遼寧省各大醫(yī)院痰液標(biāo)本中分離出的病原菌進(jìn)行回顧性統(tǒng)計(jì)分析并對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行藥物敏感性分析，以期為臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 病原菌分離自遼寧省各大醫(yī)院2015年1月至2019年12月住院患者下呼吸道8 956例痰液標(biāo)本。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(StaphyloccocusaureusATCC25923)、大腸埃希菌ATCC25922(EscherichiacoilATCC25922)、銅綠假單胞菌ATCC27853(PseudomonasaeruginosaATCC27853)、糞腸球菌ATCC29212(EnterococcusfaecalisATCC29212)和肺炎克雷伯菌ATCC700603(KlebsiellapneumoniaATCC700603)。菌株分離培養(yǎng)嚴(yán)格按照衛(wèi)生部《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 血培養(yǎng)基(BA)、伊紅-美蘭培養(yǎng)基(EMB)、巧克力培養(yǎng)基(CBA)、TTC-沙氏培養(yǎng)基、苛養(yǎng)菌藥敏瓊脂培養(yǎng)基(HTM)和M-H培養(yǎng)基均由鄭州安圖生物工程有限公司提供；革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡(VITEK 2美國(guó)bioMerieux，Inc)、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡(VITEK 2 美國(guó)bioMerieux，Inc)、奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡(VITEK 2美國(guó) bioMerieux，Inc)、革蘭陰性細(xì)菌藥敏卡(VITEK 2 compact美國(guó)bioMerieux，Inc)、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌藥敏卡(VITEK 2 compact 美國(guó)bioMerieux，Inc)和肺炎鏈球菌藥敏卡(VITEK 2 compact 美國(guó)bioMerieux，Inc)均由法國(guó)梅里埃公司提供。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 全自動(dòng)微生物鑒定儀(VITEK 2 Compact，法國(guó)梅里埃)；二氧化碳培養(yǎng)箱(371，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；微生物恒溫培養(yǎng)箱(BJPX-150，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；生物安全柜(BSC-1500IIA2-X，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；顯微鏡(CX-31，奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集接收與處理 晨痰采集前1～2 h不可進(jìn)食，采集標(biāo)本前用冷開水漱口，用力咳出呼吸道深部的痰液并直接吐入無(wú)菌容器中。標(biāo)本立即送入實(shí)驗(yàn)室，盡快進(jìn)行涂片和接種。取痰液的膿性部分直接涂片，進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡低倍視野下觀察記錄5個(gè)視野的細(xì)胞平均數(shù)，每個(gè)低倍鏡視野中，鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)，白細(xì)胞>25個(gè)，為合格下呼吸道標(biāo)本。將濃痰加入含有15～20 mL滅菌生理鹽水試管中，劇烈震蕩5～10 s，然后用接種環(huán)將沉淀于管底的濃痰小片沾出，再放入另一試管內(nèi)，以同樣的方法反復(fù)2次，最后將剩余的濃痰接種在培養(yǎng)基上。將涂片檢查合格的痰標(biāo)本處理后接種于BA、EMB、CBA和TTC-沙氏培養(yǎng)基，其中CBA置于CO2環(huán)境下，以便分離嗜血桿菌與腦膜炎奈瑟菌，TTC-沙氏培養(yǎng)基用于分離念珠菌和其他酵母菌等。

1.2.2 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn) 挑取分離純化培養(yǎng)的菌落涂片進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征形態(tài)，再經(jīng)氧化酶、觸酶試驗(yàn)、法國(guó)梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)(MIC)，結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[6]判讀為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用瑞美LIS系統(tǒng)對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分布

2015年1月至2019年12月共收集痰標(biāo)本8 956株，陽(yáng)性標(biāo)本3 878株，陽(yáng)性率43.3%，其中革蘭陰性桿菌2 673株，占68.9%。銅綠假單胞菌785株，陽(yáng)性率20.2%。革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陽(yáng)性桿菌分別占7.3%和4.2%。真菌所占比例為19.6%。具體情況見表1、圖1、圖2。

表1 3 878株下呼吸道感染病原菌菌株分布

圖1 2015年1月至2019年12月痰標(biāo)本陽(yáng)性菌分布圖Fig.1 Distribution of positive bacteria in sputum samples from January 2015 to December 2019

圖2 下呼吸道感染病原菌2 673株革蘭陰性桿菌分布圖Fig.2 Distribution of 2 673 strains of gram negative bacilli causing lower respiratory tract infection

2.2 藥敏結(jié)果

銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林、呋喃妥英、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛(酯)、頭孢曲松、頭孢替坦、頭孢唑啉的耐藥性較高，每年的耐藥率均高于95%。而對(duì)于阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、左氧氟沙星則出現(xiàn)較低的耐藥性，5年的耐藥率均低于50%。銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南的耐藥率有逐年下降的趨勢(shì)，而對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率有逐年上升的趨勢(shì)。具體耐藥情況見表2、圖3。

表2 2015年至2019年痰標(biāo)本分離銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)

圖3 2015年至2019年銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥率的變化趨勢(shì)Fig.3 Change trend of resistance rate of Pseudomonas aeruginosa to commonly used clinical antibiotics from 2015 to 2019

3 討 論

下呼吸道感染是臨床常見的感染性疾病，痰培養(yǎng)對(duì)于下呼吸道感染的病原菌檢查具有重要的臨床價(jià)值，藥敏試驗(yàn)為臨床合理使用抗生素提供了依據(jù)[7]。通過本研究可以看出，遼寧省下呼吸道感染患者的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主，占68.9%，且有上升趨勢(shì)，主要包括銅綠假單胞菌、克雷伯菌屬和不動(dòng)桿菌屬，與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外統(tǒng)計(jì)資料顯示革蘭陰性桿菌引起下呼吸道感染比例上升已逐漸趨于主導(dǎo)地位的報(bào)道一致[6]。真菌占下呼吸道感染病原菌的19.6%，主要以白假絲酵母菌、曲霉菌、熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌常見。革蘭陽(yáng)性菌主要為溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、紋帶棒桿菌和表皮葡萄球菌。

在分離出的病原菌中，銅綠假單胞菌占相當(dāng)大的比例，約為20.2%。近年來(lái)，由于β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物、免疫抑制劑和腫瘤化療藥物的廣泛使用以及各種侵入性操作的增多，該菌引起的醫(yī)院感染日益突出[8]。銅綠假單胞菌具有多種天然和獲得性耐藥機(jī)制，耐藥性強(qiáng)，耐藥機(jī)制復(fù)雜，且具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，分布廣泛，可導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)感染[9]。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制主要有通過主動(dòng)外排機(jī)制、藥物滲透障礙(由于產(chǎn)生了細(xì)菌生物被膜所導(dǎo)致)、產(chǎn)生細(xì)菌生物被膜以及產(chǎn)生由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶及DNA旋轉(zhuǎn)酶等產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[10]。

臨床治療銅綠假單胞菌嚴(yán)重感染的標(biāo)準(zhǔn)方案是將一種抗假單胞菌的β-內(nèi)酰胺類(如哌拉西林)和氟喹諾酮類(如左氧氟沙星、環(huán)丙沙星)或氨基糖苷類(如阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素)聯(lián)合應(yīng)用，聯(lián)合用藥能產(chǎn)生附加或協(xié)同殺菌作用，同時(shí)可減少耐藥的發(fā)生。其中阿米卡星是聯(lián)合用藥的首選藥物[11-12]。藥敏結(jié)果顯示，遼寧省的銅綠假單胞菌耐藥性較高的藥物主要有氨芐西林、呋喃妥英、復(fù)方新諾明、頭孢呋辛(酯)、頭孢曲松、頭孢替坦、頭孢唑啉。因此建議臨床減少使用這類抗生素，降低其耐藥性。而對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、左氧氟沙星的耐藥率相對(duì)都比較低。銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南的耐藥率有逐年下降的趨勢(shì)，而對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率有逐年上升的趨勢(shì)。阿米卡星除對(duì)銅綠假單胞菌有較好的抑制作用外，報(bào)道顯示，其他一些革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、耐碳青霉烯類革蘭陰性菌等)對(duì)其均有較高的敏感性[13-14]。阿米卡星已被臨床用于重癥肺炎的治療[15]。頭孢吡肟、美羅培南、亞胺培南對(duì)其他革蘭陰性菌作用不盡相同，有報(bào)道顯示[16]，大腸埃希菌對(duì)美羅培南、亞胺培南均有較高的敏感性，但對(duì)頭孢吡肟卻有較高耐藥性；鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢吡肟敏感性較高，但對(duì)美羅培南、亞胺培南的耐藥性卻較高。

呼吸道感染病原菌診斷的重要手段是痰培養(yǎng)，也是臨床醫(yī)師選用有效抗菌藥物的重要依據(jù)[17]。因此，臨床醫(yī)師對(duì)于呼吸道感染性疾病患者在治療前應(yīng)給予痰培養(yǎng)，然后依據(jù)本地區(qū)病原菌特點(diǎn)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性用藥，得知痰培養(yǎng)藥敏結(jié)果后再調(diào)整抗菌藥物。同時(shí)，在臨床實(shí)踐工作中，臨床醫(yī)務(wù)人員應(yīng)與細(xì)菌室工作人員密切配合，保證微生物診斷的結(jié)果與質(zhì)量。細(xì)菌室工作人員應(yīng)定期對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為臨床合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。為了避免耐藥菌株的逐年上升和產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌的現(xiàn)象，應(yīng)避免抗生素的濫用，共同營(yíng)造一個(gè)和諧的醫(yī)療環(huán)境。