王 琳， 章朦玥， 薛金艷， 南 寧， 王 丹， 張怡軒*

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司，遼寧 本溪 117004)

宮頸癌是全球女性中第四大最常見(jiàn)的癌癥[1]，也是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。全世界每年被診斷患有宮頸癌的婦女約有50萬(wàn)人，死亡率為9%，且在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下[3]。我國(guó)每年新增宮頸鱗狀細(xì)胞癌13萬(wàn)例，占全球新診斷病例的28%[4]。哈拉爾德·楚爾·豪森1972年提出人乳頭瘤病毒(HPV)導(dǎo)致宮頸癌，由此獲得2008年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)[5]。臨床研究表明，宮頸炎、宮頸癌前病變以及宮頸癌患者發(fā)病多與HPV的感染有關(guān)[6]，機(jī)體對(duì)HPV感染以局部免疫應(yīng)答為主，其持續(xù)感染與免疫應(yīng)答異常密切相關(guān)[7]，在免疫應(yīng)答過(guò)程中，以γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-21(IL-21)為代表的細(xì)胞因子在細(xì)胞免疫、體液免疫和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[8]。外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架(Nocardiarubracell wall skeleton, Nr-CWS，國(guó)藥準(zhǔn)字S20030009)由紅色諾卡菌經(jīng)過(guò)固體擴(kuò)增發(fā)酵收集、細(xì)胞破碎、精細(xì)提純、滅菌后獲得，再加入輔料凍干等一系列步驟制得成品。主要成分為胞壁酸、阿拉伯半乳聚糖、粘肽(肽聚糖PGN)，可以有效清除HPV亞型感染，逆轉(zhuǎn)低度宮頸細(xì)胞學(xué)異常[9], 并增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合[10]，具有免疫活性強(qiáng)、副作用小的特點(diǎn)[11]。已有研究表明，當(dāng)HPV持續(xù)感染時(shí)，巨噬細(xì)胞(M?)及朗格漢斯細(xì)胞(LC)活性低，當(dāng)外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架介入后，通過(guò)模式識(shí)別，與M?和LC的相應(yīng)的表面表達(dá)結(jié)合，促進(jìn)M?和LC的活化增殖。同時(shí)在非特異性免疫及特異性免疫的作用下清除HPV感染[12]。培養(yǎng)基優(yōu)化的常用方法有單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)只考慮某一因素的影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)只能得到最佳因素水平的組合，都沒(méi)有研究因子之間的相互作用[13]；響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法是基于正交試驗(yàn)的缺陷而產(chǎn)生[14]，是一種處理復(fù)雜關(guān)系和優(yōu)化多種因素的實(shí)用統(tǒng)計(jì)方法[15]，它能擬合因素與響應(yīng)間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，縮短優(yōu)化時(shí)間和提高應(yīng)用可信度[16-17]，與傳統(tǒng)優(yōu)化方法比較，響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法更有利[18]。本研究擬采用Plackett-Burman法，從原培養(yǎng)基組分中找出對(duì)影響紅色諾卡菌細(xì)胞生物量的主要因素[19]，再通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)(CCD)，擬合建立描述響應(yīng)量與自變量關(guān)系的多項(xiàng)式回歸模型，找到最優(yōu)配方組合，以優(yōu)化培養(yǎng)基配方，增加紅色諾卡菌的細(xì)胞生物量，提高產(chǎn)能，并將其應(yīng)用于工廠中進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 紅色諾卡菌(Nocardiarubra) Nr-8206，由遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①甘油瓊脂培養(yǎng)基(原固體發(fā)酵培養(yǎng)基)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，甘油10 mL，NaCl 5 g，Na2HPO4·12H2O 0.3 g，瓊脂20 g，pH 7.2～7.5，蒸餾水1 000 mL，用于菌株活化和培養(yǎng)；②肉湯培養(yǎng)基：甘油瓊脂培養(yǎng)基(原固體發(fā)酵培養(yǎng)基)不加瓊脂，用于種子培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑與儀器 牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；甘油、NaCl、Na2HPO4·12H2O、瓊脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。電子天平(上海海康電子儀器廠)； LDZX-40SBI型自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；標(biāo)準(zhǔn)型PB-10全自動(dòng)pH計(jì)(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；SW-CJ-ZD型雙人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；DGG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森新試驗(yàn)儀器有限公司)；恒溫振蕩器(北京凱慕生物技術(shù)有限公司)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 紅色諾卡菌菌種活化 將菌種進(jìn)行兩代活化。將菌體均勻涂布在甘油瓊脂培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)基表面，33 ℃培養(yǎng)4 d后用1 mL無(wú)菌水沖洗斜面上的菌體，吸出菌懸液轉(zhuǎn)接至裝有甘油瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶培養(yǎng)基內(nèi)，再用2 mL無(wú)菌水沖洗斜面上的殘菌并轉(zhuǎn)接至克氏瓶培養(yǎng)基內(nèi)，L形棒涂布菌懸液于克氏瓶培養(yǎng)基表面，33 ℃培養(yǎng)4 d。

1.2.2 紅色諾卡菌的種子液制備 克氏瓶培養(yǎng)結(jié)束后，用15 mL無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)基表面的菌體，將菌體接種于肉湯培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，33 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心棄去培養(yǎng)基，加無(wú)菌水800 mL分散菌體，種子液制備完成，再將種子液輕輕晃動(dòng)使菌體均勻分散，每個(gè)克氏瓶接種5 mL。

1.2.3 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn) 選取基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分甘油、牛肉膏、蛋白胨、Na2HPO4·12H2O、NaCl 5個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取上限(+1)、下限(-1)兩個(gè)水平(表1)，以Nr-8206的細(xì)胞生物量為響應(yīng)值，得到5因素12組實(shí)驗(yàn)組合(表2)，33 ℃培養(yǎng)5 d后，將克氏瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基上的菌苔用無(wú)菌水洗下，分別離心棄去上清液，稱量菌體重量，得出最終細(xì)胞生物量。通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果找出影響細(xì)胞生物量的影響因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)變量的取值范圍

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

1.2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 將通過(guò)Plackett-Burman獲得的重要因素，以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)因素的效應(yīng)值大小確定變化步長(zhǎng)，逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.5 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析 以菌株Nr-8206的細(xì)胞生物量為主要目標(biāo)，根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)3個(gè)因素及5個(gè)水平，分別以(-1.682、-1、0、1、1.682)編碼，如表3所示，擬合建立描述響應(yīng)量與自變量關(guān)系的多項(xiàng)式回歸模型，找出重要因素的最佳配方水平。

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方應(yīng)用于工廠的生產(chǎn)發(fā)酵，進(jìn)行生產(chǎn)放大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。生產(chǎn)步驟和其后各工藝步驟不變，用以比較細(xì)胞生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)組合的結(jié)果，方差分析見(jiàn)表4，多元回歸方程：

細(xì)胞生物量(g/L)=10.36-0.107 5A+0.299 2B+1.03C-0.069 2D-0.519 2E

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

方程中A、B、C、D、E為編碼值。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.867 7，說(shuō)明回歸有效， F=7.87，說(shuō)明模型顯著。模型中因素的P值越小說(shuō)明影響越顯著，即培養(yǎng)基配方對(duì)菌株細(xì)胞生物量影響大小排序?yàn)榈鞍纂?P=0.001 7)>NaCl(P=0.034 4)>牛肉膏(P=0.167 3)>甘油(P=0.592 9)>Na2HPO4·12H2O(P=0.728 9)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇蛋白胨、NaCl、牛肉膏作為顯著性影響因素。

方差分析模型的P=0.013 0，證明回歸方程是顯著的，即模型回歸區(qū)域擬合較好，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.867 7，說(shuō)明相關(guān)性較好。調(diào)整后R2=0.757 5，說(shuō)明75.75%實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來(lái)解釋。通常變異系數(shù)(C.V.)越低，則實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，該P(yáng)B實(shí)驗(yàn)的變化系數(shù)值=6.37%，說(shuō)明可信度和精確度較好。

2.2 CCD設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將PB實(shí)驗(yàn)得到的重要因素(蛋白胨、牛肉膏、NaCl)的濃度進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。設(shè)蛋白胨變化步長(zhǎng)為△X1=4，NaCl變化步長(zhǎng)為△X2=0.8，牛肉膏變化步長(zhǎng)為△X3=1，依據(jù)T值(表4)蛋白胨和牛肉膏為正效應(yīng)，濃度依次增加；NaCl為負(fù)效應(yīng)，濃度依次減少逼近最大響應(yīng)區(qū)域，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。菌株Nr-8206的細(xì)胞生物量在第5組(蛋白胨、NaCl、牛肉膏的質(zhì)量濃度分別為24、0.8、8 g/L)水平附近最高，以該組配方值為CCD實(shí)驗(yàn)起始值進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 CCD實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Design-Expert軟件計(jì)算設(shè)計(jì)20組配方組成，實(shí)驗(yàn)組及結(jié)果見(jiàn)表6，其中第1、4、6、11、14、18組為重復(fù)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合建立響應(yīng)量與自變量的多項(xiàng)式回歸模型，應(yīng)用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程：

菌株Nr-8206細(xì)胞生物量(g/L)=14.110+0.439C+0.416B-0.513E-0.525CB+0.269CE-0.150BE-0.322C2+0.081B2+0.421E2+0.006CBE-0.085C2B+0.575C2E+0.549CB2

表6 CCD響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

方差分析中(表7)，模型的P=0.022 0，說(shuō)明該模型顯著。失擬項(xiàng)的P=0.657 2，模型失擬不顯著，所以模型正確，且多元相關(guān)系數(shù)R2=0.924 1，說(shuō)明模型擬合較好。變異系數(shù)(C.V.)為3.66%，說(shuō)明模型方程可信度、精確度較好。

表7 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

經(jīng)Design-Expert軟件分析，依據(jù)回歸方程繪制相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖見(jiàn)圖1～3，因素NaCl、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏立體分析圖走勢(shì)較陡，表明NaCl和牛肉膏交互作用、蛋白胨和牛肉膏交互作用對(duì)菌株Nr-8206細(xì)胞生物量影響顯著。

圖1 蛋白胨和NaCl對(duì)細(xì)胞生物量影響的立體分析圖Fig.1 Response surface plot of the effects of peptone and sodium chloride on cells biomass

圖2 蛋白胨和牛肉膏對(duì)細(xì)胞生物量影響的立體分析圖Fig.2 Response surface plot of the effects of peptone and beef extract on cells biomass

圖3 牛肉膏和氯化鈉對(duì)細(xì)胞生物量影響的立體分析圖Fig.3 Response surface plot of the effects of beef extract and sodium chloride on cells biomass

理論極值編碼水平(1，-1，1)的響應(yīng)值為15.941 g/L，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(見(jiàn)表6，CCD設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)編號(hào)第20組),理論極值編碼水平的實(shí)際細(xì)胞生物量為16.0 g/L，不是此次設(shè)計(jì)組中最高細(xì)胞生物量組(見(jiàn)表6，第12組細(xì)胞生物量為16.075 g/L)，故結(jié)合預(yù)測(cè)配方和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，編碼水平中E(NaCl)的編碼定為-1=0.8 g/L，即最陡爬坡試驗(yàn)的最佳組合(見(jiàn)表4，第5組)的NaCl取值，得出新配方(1，-1，0)帶入擬合方程：

預(yù)測(cè)最高值點(diǎn)(Z1,Z2,Z3)=(1.000，-1.000, 1.000)

優(yōu)化后配方：蛋白胨42 g/L，牛肉膏8 g/L，NaCL 1.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.3 g/L，甘油 10 mL/L，pH 7.2～7.5。再次進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)此次優(yōu)化配方的細(xì)胞生物量比原始配方的生物量高231%。

2.2.3 最佳培養(yǎng)基配方的驗(yàn)證 為了確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按最佳優(yōu)化配方進(jìn)行企業(yè)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)證明，原發(fā)酵培養(yǎng)基配方獲得的細(xì)胞生物量平均為141.21 g/批次；優(yōu)化后的配方獲得的細(xì)胞生物量平均為287.8 g/批次提高了104%。

3 討 論

對(duì)紅色諾卡菌培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，在原培養(yǎng)基組分中，影響細(xì)胞生物量的主要因素為蛋白胨、NaCl，其次為牛肉膏,甘油和Na2HPO4·12H2O影響微弱。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法獲得的最佳固體培養(yǎng)基配方為蛋白胨42 g/L、牛肉膏8 g/L、NaCl 1.2 g/L、甘油10 mL/L、Na2HPO4·12H2O 0.3 g/L、瓊脂20 g/L；經(jīng)過(guò)CCD實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化配方的細(xì)胞生物量為16.075 g/L，原始配方的細(xì)胞生物量為4.85 g/L，優(yōu)化配方的細(xì)胞生物量比原始配方的細(xì)胞生物量高231%。在工廠驗(yàn)證中，采用優(yōu)化配方培養(yǎng)菌株Nr-8206的平均細(xì)胞生物量達(dá)287.8 g/批次，比原配方的平均細(xì)胞生物量(141.21 g/批次)高104%。企業(yè)生產(chǎn)的外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架為HPV感染的真正的對(duì)癥治療藥品，其固體發(fā)酵周期長(zhǎng)、工作量大。優(yōu)化后的配方使紅色諾卡菌固體發(fā)酵的細(xì)胞生物量提高了104%，解決了目前固體發(fā)酵產(chǎn)能低的短板，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和減少員工的工作強(qiáng)度作用明顯。經(jīng)過(guò)固體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，證明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)應(yīng)用在提高紅色諾卡菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面是可行的，為紅色諾卡菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化、液體發(fā)酵的優(yōu)化研究提供依據(jù)。