◎ 陸 雯，彭醒醒，朱晗昀，俞琦婭，王 珍

（綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000）

能力驗(yàn)證是認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的重要方式，它已經(jīng)成為中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)保障實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的手段[1]。參加能力驗(yàn)證可幫助實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)潛在問題，及時(shí)采取預(yù)防措施，提高實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力和管理水平。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是重要的食源性致病菌。VP 為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，具有嗜鹽性，主要存在于海產(chǎn)品中，是許多沿海國家發(fā)生食物中毒的重要病原菌之一，該病菌在中國位居食源性細(xì)菌感染疾患的前3 位[2]。李斯特菌屬（Liareria）共分2 個(gè)群，7 個(gè)種，LM 簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性短桿菌，是唯一能引起人畜共患病的病原菌，20 世紀(jì)90 年代被WHO 列為四大食源性致病菌之一，其余3 種為大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。LM 能引起腸胃炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等，對(duì)免疫力低下、孕婦等人群影響較大，廣泛存在于自然界中[3-4]。目前，VP 和LM的檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)、全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)等，如熒光定量PCR 檢測法、MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF-MS）、微流控檢測等[4-8]。本實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)及普通生化鑒定的方法，結(jié)合熒光定量PCR 檢測法和MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果，分析過程中出現(xiàn)的可疑現(xiàn)象，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

ACAS-PT1599 食品中副溶血性弧菌（定性）檢測能力驗(yàn)證、ACAS-PT1366 乳粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（定性）檢測能力驗(yàn)證，各2 份樣品，均由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院組織實(shí)施。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

3%TSA、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS、弧菌顯色培養(yǎng)基、LM 生化鑒定試劑盒、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)與配套添加劑、LM 顯色培養(yǎng)基、PALCAM 瓊脂、TSA-YE 瓊脂，購自海博生物技術(shù)有限公司；副溶血性弧菌細(xì)菌生化鑒定盒，購自環(huán)凱微生物科技有限公司；羊血瓊脂平板，購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；Premix Ex TaqTM（RR390Q）試劑盒，購自寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物探針

采用《出口食品中食源性致病菌檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 1870 2016）[12]提供的引物探針序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 對(duì)照菌株

副溶血性弧菌ATCC17802、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CICC23929、英諾克李斯特氏菌ATCC33090、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌ATCC35967，均為本實(shí)驗(yàn)室保存的工作菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250F 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HFSafe-1500LC 生物安全柜，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；BagnMixer400CC 拍擊氏均質(zhì)器，法國英特塞恩斯有限公司；BSA224S 電子天平，德國賽多利斯公司；精密移液器，德國艾本德股份公司；CFX96熒光定量PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；rapifleX MALDI-TOF-MS，美國布魯克道爾頓公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)方法

（1）傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7 2013）[9]檢測2 個(gè)樣品。

（2）熒光定量PCR 擴(kuò)增。取經(jīng)GB 4789.7 2013[9]中的方法增菌的培養(yǎng)物1 mL，置于1.5 mL 離心管中，8 000 r·min-1離心1 min，棄去液體，沉淀物用無菌水反復(fù)清洗離心2 次，用100 μL 無菌水制成菌懸液，100 ℃處理5 min，此液體作為模板，根據(jù)SN/T 1870 2016[12]，開展副溶血性弧菌熒光定量PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

（3）飛行質(zhì)譜鑒定。用1 μL 接種環(huán)挑取經(jīng)過3%TSA純化的可疑菌落，均勻涂布于靶板上，滴加1 μL MS-CHCA 基質(zhì)液，待其干燥，放入飛行質(zhì)譜儀器進(jìn)行檢測，自動(dòng)圖譜分析，給出確信分值，得出鑒定結(jié)果。

1.3.2 單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)方法

（1）傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30 2016）[10]第一法進(jìn)行檢測。

（2）熒光定量PCR 擴(kuò)增。分別取經(jīng)GB 4789.30 2016）[10]方法中LB1、LB2增菌的培養(yǎng)液進(jìn)行單增李斯特菌熒光定量PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，具體步驟同1.3.1（2）。

（3）飛行質(zhì)譜鑒定。取經(jīng)過TSA-YE 瓊脂培養(yǎng)基純化的可疑菌落，進(jìn)行飛行質(zhì)譜鑒定，步驟同1.3.1（3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)結(jié)果

副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。2 個(gè)樣品經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌液培養(yǎng)后變渾濁，說明樣品中存在活的微生物。培養(yǎng)物分別劃線接種平板進(jìn)行分離，培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落，TCBS平板上分離出綠色具有口香糖質(zhì)感的可疑菌落，分別轉(zhuǎn)接3%TSA 平板純化培養(yǎng)，菌落形態(tài)、氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂穿刺反應(yīng)、嗜鹽試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果均與副溶血性弧菌相符，即樣品中檢出副溶血性弧菌。

表1 副溶血性弧菌初步鑒定結(jié)果表

表2 副溶血性弧菌生化鑒定結(jié)果表

2.1.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

利用副溶血性弧菌引物探針對(duì)副溶血性弧菌樣品增菌液進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，出現(xiàn)了與副溶血性弧菌陽性對(duì)照一致的典型“S”型曲線，見圖1。在檢測開始24 h 內(nèi)，確認(rèn)樣品副溶血性弧菌陽性。

圖1 副溶血性弧菌樣品擴(kuò)增結(jié)果圖

2.1.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

副溶血性弧菌樣品經(jīng)1.3.1（3）步驟上機(jī)分析，結(jié)果顯示為副溶血性弧菌，2 個(gè)樣品得分為1.894、2.076，得分為1.7 ～3.0 表示陽性結(jié)果，檢測48 h 內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)樣品檢測結(jié)果為副溶血性弧菌陽性。

2.2 單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)結(jié)果

單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。2 個(gè)樣品經(jīng)LB1、LB2增菌液培養(yǎng)后變渾濁，說明樣品中存在活的微生物。

表3 單增李斯特菌初步鑒定結(jié)果表

表4 單增李斯特菌生化鑒定結(jié)果表

培養(yǎng)物劃線接種平板進(jìn)行分離，培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落，PALCAM 平板上分離出灰綠色中間有黑色凹陷的菌落，分別轉(zhuǎn)接TSA-YE 瓊脂平板純化培養(yǎng)，菌落形態(tài)、酶促試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、溶血試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果均與單增李斯特菌相符，但其中一個(gè)樣品的溶血試驗(yàn)可疑，溶血圈大小界于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特菌之間，如圖2 所示。結(jié)合熒光定量PCR 和飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果，排除可疑，確認(rèn)樣品中檢出單增李斯特氏菌。

圖2 單增李斯特菌樣品2 溶血試驗(yàn)結(jié)果圖

2.2.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

利用單增李斯特菌引物探針對(duì)單增李斯特菌樣品進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，出現(xiàn)了與單增李斯特菌陽性對(duì)照一致的典型“S”型曲線，見圖3。在檢測24 ～48 h 內(nèi)確認(rèn)樣品檢測結(jié)果為單增李斯特氏菌陽性。

2.2.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

單增李斯特菌樣品經(jīng)過上機(jī)分析，結(jié)果顯示為單增李斯特菌，得分在1.7 以上，得分1.7 ～3.0 表示陽性結(jié)果，在檢測開始48 h 內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)樣品檢測結(jié)果為單增李斯特菌陽性。

3 結(jié)論與討論

ACAS-PT1599 的2 個(gè)樣品均檢出副溶血性弧菌，ACAS-PT1366 的2 個(gè)樣品均檢出單增李斯特菌，上報(bào)結(jié)果后獲得滿意結(jié)果。本次能力驗(yàn)證采用了常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法，借助熒光定量PCR 法和飛行質(zhì)譜進(jìn)行輔助確認(rèn)，使結(jié)果更加可靠。此外，檢測人員掌握了不同方法，提高了檢測人員和實(shí)驗(yàn)室的檢測水平。

副溶血性弧菌和單增李斯特菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測周期一般需要4 ～7 d，副溶血性弧菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法中的嗜鹽試驗(yàn)需通過肉眼判斷菌體的生長情況，易出現(xiàn)偏差，單增李斯特菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法中溶血試驗(yàn)表現(xiàn)出狹窄清晰的溶血圈，但本次單增李斯特菌能力驗(yàn)證中樣品2 分離的可疑菌落表現(xiàn)出的溶血圈大小介于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特氏菌之間，在結(jié)果判定上存在干擾。利用熒光定量PCR 儀或飛行質(zhì)譜不僅可在48 h 內(nèi)確認(rèn)結(jié)果，還能排除傳統(tǒng)方法鑒定確認(rèn)過程中的可疑菌落，使結(jié)果更可靠。