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        食品中副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能力驗(yàn)證結(jié)果分析

        2023-09-05 04:21:22彭醒醒朱晗昀俞琦婭
        現(xiàn)代食品 2023年13期
        關(guān)鍵詞:單增氏菌溶血性

        ◎ 陸 雯,彭醒醒,朱晗昀,俞琦婭,王 珍

        (綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司,浙江 杭州 310000)

        能力驗(yàn)證是認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的重要方式,它已經(jīng)成為中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)保障實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的手段[1]。參加能力驗(yàn)證可幫助實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)潛在問題,及時(shí)采取預(yù)防措施,提高實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力和管理水平。

        副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的食源性致病菌。VP 為革蘭氏陰性無芽孢桿菌,具有嗜鹽性,主要存在于海產(chǎn)品中,是許多沿海國家發(fā)生食物中毒的重要病原菌之一,該病菌在中國位居食源性細(xì)菌感染疾患的前3 位[2]。李斯特菌屬(Liareria)共分2 個(gè)群,7 個(gè)種,LM 簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,為革蘭氏陽性短桿菌,是唯一能引起人畜共患病的病原菌,20 世紀(jì)90 年代被WHO 列為四大食源性致病菌之一,其余3 種為大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。LM 能引起腸胃炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等,對(duì)免疫力低下、孕婦等人群影響較大,廣泛存在于自然界中[3-4]。目前,VP 和LM的檢測(cè)技術(shù)主要有傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)、全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)等,如熒光定量PCR 檢測(cè)法、MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-Time of Flight Mass Spectrometer,MALDI-TOF-MS)、微流控檢測(cè)等[4-8]。本實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)及普通生化鑒定的方法,結(jié)合熒光定量PCR 檢測(cè)法和MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)結(jié)果,分析過程中出現(xiàn)的可疑現(xiàn)象,提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 樣品來源

        ACAS-PT1599 食品中副溶血性弧菌(定性)檢測(cè)能力驗(yàn)證、ACAS-PT1366 乳粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(定性)檢測(cè)能力驗(yàn)證,各2 份樣品,均由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院組織實(shí)施。

        1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

        3%TSA、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS、弧菌顯色培養(yǎng)基、LM 生化鑒定試劑盒、李氏菌增菌肉湯(LB1,LB2)基礎(chǔ)與配套添加劑、LM 顯色培養(yǎng)基、PALCAM 瓊脂、TSA-YE 瓊脂,購自海博生物技術(shù)有限公司;副溶血性弧菌細(xì)菌生化鑒定盒,購自環(huán)凱微生物科技有限公司;羊血瓊脂平板,購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司;Premix Ex TaqTM(RR390Q)試劑盒,購自寶生物工程有限公司。

        1.1.3 引物探針

        采用《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》(SN/T 1870 2016)[12]提供的引物探針序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.1.4 對(duì)照菌株

        副溶血性弧菌ATCC17802、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CICC23929、英諾克李斯特氏菌ATCC33090、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌ATCC35967,均為本實(shí)驗(yàn)室保存的工作菌株。

        1.2 儀器與設(shè)備

        LRH-250F 生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HFSafe-1500LC 生物安全柜,力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;BagnMixer400CC 拍擊氏均質(zhì)器,法國英特塞恩斯有限公司;BSA224S 電子天平,德國賽多利斯公司;精密移液器,德國艾本德股份公司;CFX96熒光定量PCR 儀,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;rapifleX MALDI-TOF-MS,美國布魯克道爾頓公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)方法

        (1)傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》(GB 4789.7 2013)[9]檢測(cè)2 個(gè)樣品。

        (2)熒光定量PCR 擴(kuò)增。取經(jīng)GB 4789.7 2013[9]中的方法增菌的培養(yǎng)物1 mL,置于1.5 mL 離心管中,8 000 r·min-1離心1 min,棄去液體,沉淀物用無菌水反復(fù)清洗離心2 次,用100 μL 無菌水制成菌懸液,100 ℃處理5 min,此液體作為模板,根據(jù)SN/T 1870 2016[12],開展副溶血性弧菌熒光定量PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

        (3)飛行質(zhì)譜鑒定。用1 μL 接種環(huán)挑取經(jīng)過3%TSA純化的可疑菌落,均勻涂布于靶板上,滴加1 μL MS-CHCA 基質(zhì)液,待其干燥,放入飛行質(zhì)譜儀器進(jìn)行檢測(cè),自動(dòng)圖譜分析,給出確信分值,得出鑒定結(jié)果。

        1.3.2 單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)方法

        (1)傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.30 2016)[10]第一法進(jìn)行檢測(cè)。

        (2)熒光定量PCR 擴(kuò)增。分別取經(jīng)GB 4789.30 2016)[10]方法中LB1、LB2增菌的培養(yǎng)液進(jìn)行單增李斯特菌熒光定量PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),具體步驟同1.3.1(2)。

        (3)飛行質(zhì)譜鑒定。取經(jīng)過TSA-YE 瓊脂培養(yǎng)基純化的可疑菌落,進(jìn)行飛行質(zhì)譜鑒定,步驟同1.3.1(3)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)結(jié)果

        副溶血性弧菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。2 個(gè)樣品經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌液培養(yǎng)后變渾濁,說明樣品中存在活的微生物。培養(yǎng)物分別劃線接種平板進(jìn)行分離,培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落,TCBS平板上分離出綠色具有口香糖質(zhì)感的可疑菌落,分別轉(zhuǎn)接3%TSA 平板純化培養(yǎng),菌落形態(tài)、氧化酶試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂穿刺反應(yīng)、嗜鹽試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果均與副溶血性弧菌相符,即樣品中檢出副溶血性弧菌。

        表1 副溶血性弧菌初步鑒定結(jié)果表

        表2 副溶血性弧菌生化鑒定結(jié)果表

        2.1.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

        利用副溶血性弧菌引物探針對(duì)副溶血性弧菌樣品增菌液進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng),出現(xiàn)了與副溶血性弧菌陽性對(duì)照一致的典型“S”型曲線,見圖1。在檢測(cè)開始24 h 內(nèi),確認(rèn)樣品副溶血性弧菌陽性。

        圖1 副溶血性弧菌樣品擴(kuò)增結(jié)果圖

        2.1.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

        副溶血性弧菌樣品經(jīng)1.3.1(3)步驟上機(jī)分析,結(jié)果顯示為副溶血性弧菌,2 個(gè)樣品得分為1.894、2.076,得分為1.7 ~3.0 表示陽性結(jié)果,檢測(cè)48 h 內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)樣品檢測(cè)結(jié)果為副溶血性弧菌陽性。

        2.2 單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果

        2.2.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗(yàn)結(jié)果

        單增李斯特菌樣品檢驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。2 個(gè)樣品經(jīng)LB1、LB2增菌液培養(yǎng)后變渾濁,說明樣品中存在活的微生物。

        表3 單增李斯特菌初步鑒定結(jié)果表

        表4 單增李斯特菌生化鑒定結(jié)果表

        培養(yǎng)物劃線接種平板進(jìn)行分離,培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落,PALCAM 平板上分離出灰綠色中間有黑色凹陷的菌落,分別轉(zhuǎn)接TSA-YE 瓊脂平板純化培養(yǎng),菌落形態(tài)、酶促試驗(yàn)、革蘭氏染色鏡檢、溶血試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果均與單增李斯特菌相符,但其中一個(gè)樣品的溶血試驗(yàn)可疑,溶血圈大小界于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特菌之間,如圖2 所示。結(jié)合熒光定量PCR 和飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果,排除可疑,確認(rèn)樣品中檢出單增李斯特氏菌。

        圖2 單增李斯特菌樣品2 溶血試驗(yàn)結(jié)果圖

        2.2.2 熒光定量PCR 擴(kuò)增結(jié)果

        利用單增李斯特菌引物探針對(duì)單增李斯特菌樣品進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng),出現(xiàn)了與單增李斯特菌陽性對(duì)照一致的典型“S”型曲線,見圖3。在檢測(cè)24 ~48 h 內(nèi)確認(rèn)樣品檢測(cè)結(jié)果為單增李斯特氏菌陽性。

        2.2.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

        單增李斯特菌樣品經(jīng)過上機(jī)分析,結(jié)果顯示為單增李斯特菌,得分在1.7 以上,得分1.7 ~3.0 表示陽性結(jié)果,在檢測(cè)開始48 h 內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)樣品檢測(cè)結(jié)果為單增李斯特菌陽性。

        3 結(jié)論與討論

        ACAS-PT1599 的2 個(gè)樣品均檢出副溶血性弧菌,ACAS-PT1366 的2 個(gè)樣品均檢出單增李斯特菌,上報(bào)結(jié)果后獲得滿意結(jié)果。本次能力驗(yàn)證采用了常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法,借助熒光定量PCR 法和飛行質(zhì)譜進(jìn)行輔助確認(rèn),使結(jié)果更加可靠。此外,檢測(cè)人員掌握了不同方法,提高了檢測(cè)人員和實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。

        副溶血性弧菌和單增李斯特菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)周期一般需要4 ~7 d,副溶血性弧菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法中的嗜鹽試驗(yàn)需通過肉眼判斷菌體的生長(zhǎng)情況,易出現(xiàn)偏差,單增李斯特菌常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法中溶血試驗(yàn)表現(xiàn)出狹窄清晰的溶血圈,但本次單增李斯特菌能力驗(yàn)證中樣品2 分離的可疑菌落表現(xiàn)出的溶血圈大小介于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特氏菌之間,在結(jié)果判定上存在干擾。利用熒光定量PCR 儀或飛行質(zhì)譜不僅可在48 h 內(nèi)確認(rèn)結(jié)果,還能排除傳統(tǒng)方法鑒定確認(rèn)過程中的可疑菌落,使結(jié)果更可靠。

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