郝 果，董 梅，李 璐，張耀武

（1.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），陜西富平 711700；2.渭南市檢驗檢測研究院，陜西渭南 714000；3.西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，陜西西安 710065）

達唑是一類無臭，無味，不溶于水，微溶于丙酮或氯仿的白色或類白色粉末。其主要分為噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑和苯硫氨酯，是一類合成的抗寄生蟲藥物，由于其高效性和廣譜性，在農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用于治療吸蟲和線蟲感染[1]。但不正確的使用會使其在食用動植物產(chǎn)品中殘留，并通過食物鏈在人體中累積，對人體健康構(gòu)成潛在的危害[2]。動物實驗證明，某些達唑具有致畸和致突變的作用[3]，因此達唑被中國、美國和歐盟等多個國家和地區(qū)列為獸藥殘留的重要監(jiān)控對象[4]，并制定了最大殘留限量[5]。達唑?qū)θ梭w的毒性與血清白蛋白的儲運功能密切相關(guān)[6]。血清白蛋白作為人和動物血漿中重要的載體蛋白，可與多種外源性物質(zhì)結(jié)合，影響其在生物體中的儲存、分布、代謝和毒性[7]。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中對噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑和苯硫氨酯的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)有規(guī)定，不同靶組織殘留限量不一，在奶中的限量均為100 μg·kg-1[8]。

快速、準(zhǔn)確的檢測方法能對達唑的限量設(shè)置提供強有力的技術(shù)支撐。達唑常用的檢測方法有很多[9-11]，主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法、免疫分析法、電化學(xué)法和熒光檢測法等，其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因普及率高、準(zhǔn)確性好被廣泛應(yīng)用[12-14]。

《牛奶和奶粉中噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑、苯硫氨酯殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 22972—2008）樣品前處理較復(fù)雜耗時，本研究參照GB/T 22972—2008，稱取10 g羊奶或奶粉經(jīng)溶解復(fù)原后的羊奶復(fù)原乳置于100 mL離心管中，加入30 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取30 min，4 000 r·min-1離 心5 min，取上 清液置于40 ℃水浴上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，然后用碳酸鹽緩沖溶液定容至10 mL，過0.22 μm濾膜上高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測，同時確定了檢測器條件，建立了一種準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的羊乳及羊乳粉中達唑含量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1290-6460（配ESI源）（美國安捷倫科技有限公司）；十萬分之一天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；百分之一電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；旋渦混合器Vortex-6（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器KQ2200DE（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

噻苯達唑標(biāo)品（21070925，純度99.9%，壇墨質(zhì)檢）；阿苯達唑標(biāo)品（2502008，純度97.2%，壇墨質(zhì)檢）；芬苯達唑標(biāo)品（21090304，純度99.7%，壇墨質(zhì)檢）；奧芬達唑標(biāo)品（1371801，純度88.0%，壇墨質(zhì)檢）；苯硫氨酯標(biāo)品（21090311，純度99.9%，壇墨質(zhì)檢）。

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，150 A，美國安捷倫科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，美國sigma公司）；水為實驗室自制超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相洗脫條件和質(zhì)譜條件的選擇

分離條件以GB/T 22972—2008[7]為基礎(chǔ)，依據(jù)儀器條件和色譜柱的不同進行調(diào)整，使5個組分能完全分離。

1.2.2 樣品制備方式的選擇

按照提取、凈化、濃縮的步驟制備試樣，以回收率考察方法的準(zhǔn)確性。回收率的計算參考GB/T 27417—2017[14]中回收率的計算。

1.2.3 定量限的測定

在羊奶和羊奶粉中添加目標(biāo)化合物，做平行樣，測基線噪音值，依據(jù)特征離子色譜峰rSN＞10為方法定量限，測定方法的定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相洗脫條件和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：1.0 μL；流動相洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.1.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+；霧化器壓力：30 psi；毛細管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L·min-1；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；其他參數(shù)見表2。

表2 各組分質(zhì)譜分析參數(shù)表

2.2 凈化條件的優(yōu)化

由于羊奶及羊奶粉中含有大量的蛋白質(zhì)以及脂類物質(zhì)，容易形成基質(zhì)干擾，因此必須對其進行凈化處理，以減少基質(zhì)效應(yīng)。凈化的方式主要有液液分配和固相萃取兩種方式。研究分別比較了乙腈直接提取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容過濾膜上機測定和經(jīng)C18固相萃取柱凈化氮吹定容過濾膜上機測定。結(jié)果顯示，C18固相萃取柱的回收率較低，沒有乙腈提取旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容直接過濾膜的回收率高，因此選擇乙腈直接提取的方式。

2.3 樣品處理

羊奶樣品稱樣10 g（精確至0.01 g）于100 mL具塞離心管中，加入30 mL乙腈，渦旋混勻3 min，超聲30 min，以4 000 r·min-1離心5 min，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，用碳酸鹽緩沖溶液定容至10 mL。過0.22 μm濾膜供高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。同時做平行試驗和空白試驗。

羊奶粉樣品稱取12.5 g于燒杯中，加適量35～45 ℃水將其充分溶解，待冷卻至室溫后，加水至100 g，混勻，其余步驟同羊奶。

2.4 線性范圍、線性方程

以峰面積y為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，建立回歸方程，各組分回歸方程如表3所示。

表3 各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程表

結(jié)果表明，阿苯達唑、芬苯達唑、噻苯達唑、奧芬達唑和苯硫氨酯在10.08～584.00 ng·mL-1相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，濃度與峰面積呈線性關(guān)系，線性良好，符合要求。

2.5 重復(fù)性

平行稱取6份羊奶樣品和羊奶粉樣品，加入同一水平的5組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照2.3進行樣品處理，2.1條件進行測定，計算變異系數(shù)，結(jié)果見表4、表5。結(jié)果表明變異系數(shù)均在1.76%～5.08%，實驗結(jié)果符合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中試樣測試結(jié)果的重復(fù)性要求。

表4 羊奶樣品重復(fù)性實驗結(jié)果

表5 羊奶粉樣品重復(fù)性實驗結(jié)果

2.6 精密度

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列4重復(fù)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表6，變異系數(shù)在2.23%～6.40%，實 驗 結(jié) 果 符 合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中試樣測試結(jié)果的重復(fù)性要求。

表6 精密度實驗結(jié)果

2.7 定量限和檢出限

稱取2份羊奶空白樣品，準(zhǔn)確加入各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液至檢出限濃度，即0.01 mg·kg-1，按照2.3的操作，通過比較分析物樣品與空白樣品測量的信號，以驗證標(biāo)準(zhǔn)給出的方法檢出限，可接受的信噪比在3∶1以上，為可用檢出限，按2.3操作，2.1測定，信噪比值在57.20 ～ 456.14。經(jīng)驗證，羊奶中的噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑和苯硫氨酯的檢出限 為0.01 mg·kg-1，滿 足GB/T 22972—2008對5種組分檢出限的要求。

稱取奶粉樣品12.5 g，按照2.3處理樣品方法加水溶解后，加入各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液至檢出限濃度，即0.08 mg·kg-1，通過比較分析物樣品與空白樣品測量的信號，以驗證標(biāo)準(zhǔn)給出的方法檢出限，可接受的信噪比在3∶1以上，為可用檢出限，按2.3操作，2.1測定，信噪比值在47.59 ～ 447.48。經(jīng)驗證，羊奶及羊奶粉中的噻苯達唑、阿苯達唑、芬苯達唑、奧芬達唑、苯硫氨酯的檢出限為0.08 mg·kg-1，滿足GB/T 22972—2008對5種組分檢出限的要求。

2.8 回收率

稱取羊奶空白試樣10.00 g，加入低、中、高3個水平的5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照2.3處理樣品，2.1進行測定，計算回收率。稱取奶粉樣品12.5 g，按照2.3處理樣品方法加水溶解后，加入低、中、高3個水平的5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照2.3操作，2.1測定，計算回收率?；厥章?（實測值-本底值）/加標(biāo)量×100%。

羊奶中3個濃度，結(jié)果見表7，回收率范圍61.06%～114.51%，羊奶粉中3個濃度，結(jié)果見表8，回收率范圍80.18%～115.72%，兩者回收率結(jié)果符合GB/T 27404—2008、GB/T 22972—2008中對回收率的要求。

表7 羊奶樣品中回收率實驗結(jié)果表

表8 羊奶粉樣品中回收率實驗結(jié)果表

2.9 樣品檢測結(jié)果

按照前述的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對2份質(zhì)控樣品進行檢測，結(jié)果均在范圍內(nèi)。制備加標(biāo)羊乳樣品進行分析，樣品中5種組分能夠完全分離，無干擾峰，且分析時間很短。說明該方法運用到實際樣品的檢測中可以得到較好的分離分析結(jié)果。樣品分析色譜圖見圖1。

圖1 達唑類標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC色譜圖

3 結(jié)論

羊奶樣品稱樣10 g于100 mL具塞離心管中，加入30 mL乙腈，渦旋混勻3 min，超聲30 min，以4 000 r·min-1離心5 min，移取上清液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，用碳酸鹽緩沖溶液定容至10 mL，過0.22 μm濾膜供高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。羊奶粉經(jīng)水溶解復(fù)原后同羊奶。同時做平行試驗和空白試驗。經(jīng)過優(yōu)化選擇，液相色譜條件為Agilent BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；流速：0.2 mL·min-1；進樣量：1.0 μL。質(zhì)譜條件為電離方式：ESI+；霧化器壓力：30 psi；毛細管電壓：3 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 L·min-1；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，通過測定線性范圍、重復(fù)性、精密度、加標(biāo)回收實驗以及檢出限、定量限的驗證，均得到了滿意結(jié)果。本方法前處理簡單，節(jié)約試劑耗材，用時短，優(yōu)于國標(biāo)方法，說明本檢測方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能很好地測定乳粉中的達唑含量。