況嘉鈾，李瑩瑩，鄭平，吳紫婷，劉棗*，王偉平

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

多糖是一類由多個相同或不同類型單糖以糖苷鍵方式結(jié)合而成的高分子碳水化合物，廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中，具有可以激活人體免疫細胞[1]、誘導(dǎo)癌細胞凋亡[2]、清除自由基[3]和降低血糖、血脂[4]等生物活性[5]。且多糖可以影響風(fēng)味物質(zhì)的釋放，風(fēng)味物質(zhì)相對濃度增加，從而使多糖產(chǎn)品具有更好的感官品質(zhì)[6]，因此多糖越來越多地被應(yīng)用于飲料的研制。目前，市場上大部分的多糖飲料是通過添加植物提取得到的多糖制備而成，而發(fā)酵多糖飲料產(chǎn)品較少。

紅薯是一種營養(yǎng)豐富的天然滋補食品，富含蛋白質(zhì)、多糖、多種維生素等，對促進人體腸道消化，增強人體免疫力起著重要作用[7]。我國紅薯種植面積為7500萬畝～8 000萬畝，資源豐富。紅曲菌是一種具有較高食用和藥用價值的絲狀真菌，可以產(chǎn)生紅曲色素、紅曲多糖、monacolin K、γ-氨基丁酸等多種功能活性物質(zhì)，還能產(chǎn)生天然色素和酸、醇、酯等豐富的風(fēng)味物質(zhì)[8]，其中紅曲色素是一種天然可食用色素，廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域[9]。紅曲多糖是一種真菌多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖通過β-1，3糖苷鍵組成，具有抗腫瘤、提高免疫力等生物功能。紅曲菌產(chǎn)生的其他代謝物質(zhì)還具有降血壓、降血脂等作用，在抗癌、抗疲勞、防治骨質(zhì)疏松等方面也有一定功效[10]。紅曲菌還可產(chǎn)生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亞油酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，這些風(fēng)味物質(zhì)能夠賦予紅曲產(chǎn)品豐富的香味[8]。紅曲菌不僅可以產(chǎn)生多種活性物質(zhì)還能產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，可用作發(fā)酵飲料的菌種。

不同紅曲菌代謝能力及產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力存在明顯差異[11-14]。本文以實驗室3株紅曲菌Monascus GN、H4000和Z505為研究對象，以新鮮紅薯為原料，研究不同菌株液態(tài)發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲色素、紅曲多糖等代謝產(chǎn)物能力，對發(fā)酵液進行感官評分，篩選得到優(yōu)良菌株，為以后制備紅薯紅曲多糖飲料的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅曲菌（Monascus）GN、Z505、H4000：湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏。

新鮮紅薯：市售；葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（分析純）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂（分析純）：武漢市華順生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器（GI65DWS）：致微（廈門）儀器有限公司；垂直流超凈工作臺（ZGJH-1214）、雙層特大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2112B）：上海智城分析儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052）：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機（Fresco 17）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；可見光分光光度計（722S）：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、瓊脂3%，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：新鮮紅薯洗凈去皮，切成1 cm3的方塊。新鮮紅薯塊10%、葡萄糖2%、蛋白胨0.6%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.2%，搖瓶培養(yǎng)，裝液量為200 mL/500 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：新鮮紅薯洗凈去皮，切成1cm3的方塊。新鮮紅薯塊20%、葡萄糖2%、酵母粉0.14%、蛋白胨0.8%、KH2PO40.1% 、MgSO4·7H2O 0.05% 、ZnSO40.1% 、CaCO30.1%，裝液量為100 mL/250 mL，121℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 紅薯紅曲多糖飲料工藝流程

紅曲菌→菌種活化→液體二級種子→接種發(fā)酵培養(yǎng)基→發(fā)酵→過濾除菌→后熟→調(diào)配→巴氏滅菌→灌裝→檢驗→成品。

1）菌種活化：將3種紅曲菌株分別接種到配制好的斜面培養(yǎng)基上，于30℃下恒溫培養(yǎng)1周左右。

2）液態(tài)種子培養(yǎng)：用接種環(huán)在長好的斜面培養(yǎng)基中刮取兩環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。

3）接種：將冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基接入體積分數(shù)為10%的二級種子液。

4）發(fā)酵：將接種后的培養(yǎng)基置于30℃、200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)6 d。

5）過濾除菌：將發(fā)酵后的紅曲菌發(fā)酵液經(jīng)過濾得到過濾液，再將過濾液4 000 r/min離心10 min得到上清液。

6）低溫后熟：將過濾離心得到的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中，封口，置于4℃冰箱進行低溫后熟。

7）調(diào)配：對低溫后熟后的產(chǎn)品進行產(chǎn)品調(diào)配，使產(chǎn)品符合國家標準GB/T 10789—2015《飲料通則》（含第1號修改單）。

8）巴氏滅菌、灌裝：將低溫后熟經(jīng)調(diào)配的紅曲菌發(fā)酵飲料進行巴氏滅菌，并進行灌裝。

9）成品、檢驗：對發(fā)酵飲料進行感官評分、理化及微生物指標的檢測。

1.4.2 pH值的測定

發(fā)酵液pH值采用pH計測定。

1.4.3 紅曲色價的測定

移取1 mL發(fā)酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60℃恒溫搖床中，180 r/min萃取1 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)，在410、470、505 nm處分別測定紅曲黃色素、紅曲橙色素、紅曲紅色素3種色素的吸光值。計算公式如下[15]。

紅曲色素的色價/（U/mL）=吸光值×稀釋倍數(shù)

1.4.4 紅曲多糖的測定

取過濾后的濾液5 mL，加入3倍體積的無水乙醇，在4℃醇沉48 h，取出后4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，在50℃烘箱烘干至恒重，加入蒸餾水溶解并定容至50 mL，取0.5 mL上述溶液加入1.5 mL蒸餾水，加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再加入5 mL濃H2SO4，振蕩搖勻，在沸水浴中反應(yīng)15 min，迅速冷卻，測定490 nm處吸光值[16]。

1.4.5 桔霉素的測定

桔霉素測定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，取上清液 5 mL，加入10 mL的無水乙醇，在60℃恒溫搖床中200 r/min萃取1 h，在8 000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，即得待測液。

HPLC條件：流動相為超純水（用磷酸調(diào)pH值至2.5）∶乙腈=50∶50（體積比）；熒光發(fā)射波長為 331 nm，激發(fā)波長為500 nm；色譜柱為EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；體積流量為 1 mL/min；柱溫 28 ℃；上樣量（標準品及樣品）均為20 μL。

1.4.6 感官評分方法

參考劉琨毅等[17]的方法并稍作修改，選擇10名評分員組成感官評分小組，對紅曲菌發(fā)酵液的色澤、組織狀態(tài)、香氣等方面進行評分。產(chǎn)品評分在常溫下進行，并采取隨機編碼形式。評分時需給予評分員充足的時間，并在評分的過程中不斷呼吸新鮮空氣以保證評分結(jié)果不被外來混雜氣味所干擾。感官評分內(nèi)容和標準見表1，由10人評分后取平均值。總分=色澤外觀×40%+香氣×60%。

表1 感官評分Table 1 Sensory evaluation

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗設(shè)置3個重復(fù)，每個單因素試驗進行3次平行試驗。試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進行制圖，并利用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析和顯著性t檢驗，結(jié)果通過平均值±標準差表示，P＜0.05為顯著性差異，P＞0.05為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紅曲菌種發(fā)酵最終pH值的對比分析

不同菌種發(fā)酵的最終pH值結(jié)果見圖1。

從圖1中可以得出不同紅曲菌發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)酸的代謝能力差別不顯著（P＞0.05），紅曲菌GN的產(chǎn)酸能力相對較強，其發(fā)酵最終pH值為5.00，紅曲菌Z505和紅曲菌H4000產(chǎn)酸能力較為接近，分別為5.42和5.32。導(dǎo)致紅曲發(fā)酵液呈現(xiàn)酸性的主要因素為有機酸，其中，乳酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸和酮戊二酸是紅曲發(fā)酵液中的主要有機酸，占總量的87%左右。紅曲菌產(chǎn)酸的能力主要與淀粉酶和糖化酶相關(guān)[18]，與培養(yǎng)基中無機鹽的種類和添加量也有一定的相關(guān)性[19-20]。產(chǎn)淀粉酶以及糖化酶較強的紅曲菌能更多地利用底物原料，產(chǎn)生各種初級代謝產(chǎn)物以及次級代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液中各物質(zhì)的差異性導(dǎo)致了不同紅曲菌在發(fā)酵過程中的pH值存在一定差異。其中紅曲菌GN的最終pH值低于紅曲菌Z505和H4000，可能是由于紅曲菌GN能夠產(chǎn)生較多的淀粉酶和糖化酶消耗了更多的底物原料所導(dǎo)致的。以農(nóng)產(chǎn)品為發(fā)酵原料時，農(nóng)產(chǎn)品在發(fā)酵過程中具有良好的pH緩沖性[21]。因此，在以新鮮紅薯為原料時，不同菌種對發(fā)酵最終pH值的影響不明顯。

2.2 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的對比分析

不同的菌株產(chǎn)色素能力不同[22-24]。不同菌種發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲色素的結(jié)果見圖2。

由圖2可知，紅曲菌GN產(chǎn)紅曲色素的能力較強，顏色呈深紅色，紅曲色價為239.1 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為 99.1、55.8、84.2 U/mL；紅曲菌H4000產(chǎn)紅曲色素的能力相對較弱，顏色呈橘黃色，紅曲色價為48.8 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為14.8、8.8、25.2 U/mL；紅曲菌Z505在這3株紅曲菌中產(chǎn)色素能力最弱，顏色呈橙黃色，色價為29.5 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為9.4、4.2、15.9 U/mL。紅曲色素的質(zhì)量和產(chǎn)量主要受碳源、氮源、發(fā)酵溫度、pH值、色素疏水性等因素的影響，此外，菌種的差異性也會導(dǎo)致紅曲色素的質(zhì)量和產(chǎn)量存在較大差異性。周珂等[25]利用紫色紅曲菌ZH2液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的主要為橙色素和黃色素，其橙色素和黃色素分別為152.96、108.38 U/mL。黎青華等[26]通過誘變育種獲得的紅曲菌突變株LBBE-15主要產(chǎn)紅色素，其紅曲紅色價達到1 244 U/mL。本試驗篩選出的3株紅曲菌株的發(fā)酵液顏色呈現(xiàn)出不同的顏色，且紅曲色價均不同，這是菌種的差異性導(dǎo)致的。因此可以針對不同要求，選用不同的發(fā)酵菌種進行不同產(chǎn)品的研發(fā)。

2.3 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)紅曲多糖的對比分析

不同紅曲菌株發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲多糖的結(jié)果見圖3。

由圖3可知，紅曲菌菌株Z505、GN與紅曲菌菌株H4000產(chǎn)紅曲多糖的能力存在顯著差異（P＜0.05），其中紅曲菌Z505產(chǎn)紅曲多糖的能力最強，其紅曲多糖的含量為1.89 g/L，其次是紅曲菌GN和紅曲菌H4000，其紅曲多糖含量分別為1.75g/L和1.18g/L。目前通過培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化，得到的紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲多糖含量一般為1 g/L左右[16]。大部分多糖飲料由于原料來源或制作方法的不同多糖含量差別較大，多糖飲料的含量多為 0.1 g/L～10.0 g/L[5，27-29]。本研究中 3 株紅曲菌的紅曲多糖含量均達到了1g/L以上，表明這3株紅曲菌產(chǎn)紅曲多糖能力較強，可進一步優(yōu)化培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝使紅曲多糖的產(chǎn)量得到提高。

2.4 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)桔霉素的對比分析

不同紅曲菌株發(fā)酵后上清液的桔霉素檢測結(jié)果見圖4。

由圖4可知，紅曲菌菌株Z505、H4000與紅曲菌菌株GN產(chǎn)桔霉素的能力存在顯著差異（P＜0.05）。紅曲菌GN上清液中的桔霉素濃度為0.45 mg/L，紅曲菌H4000上清液中的桔霉素濃度為0.23 mg/L，紅曲菌Z505上清液中的桔霉素濃度為0.10 mg/L。有研究報道，可以通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的物理環(huán)境因素或添加外源添加物來控制菌絲生長，影響代謝途徑，從而達到降低桔霉素的目的[30]。本研究發(fā)酵周期為6 d，桔霉素濃度隨發(fā)酵周期的延長也會發(fā)生變化，通過培養(yǎng)基優(yōu)化以及工藝優(yōu)化可進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝降低桔霉素濃度，使最終紅曲多糖發(fā)酵飲料中不含有桔霉素。

2.5 不同菌種的感官評分結(jié)果

不同紅曲菌發(fā)酵過濾液的感官評分的結(jié)果見圖5。

由圖5可知，與紅曲菌GN和H4000相比，紅曲菌Z505的感官評分具有顯著性差異（P<0.05），紅曲菌Z505的感官評分（83分）最高，這可能是由于紅曲菌Z505能夠產(chǎn)生較好酸、醇、酯等香味物質(zhì)；紅曲菌GN與H4000的感官評分均為74。通過對比發(fā)現(xiàn)紅曲菌GN發(fā)酵過濾液顏色較深，具有花香但也有較重的異味，所以評分較低；紅曲菌H4000顏色偏橘黃色，較為透亮，但有異味，故感官評分較低；紅曲菌Z505發(fā)酵過濾液雖然顏色較其他兩株菌顏色淺，但色正，透亮，且具有怡人的花果香味，因此紅曲菌Z505的評分最高。多糖可以通過改變食品質(zhì)構(gòu)或者多種作用力與風(fēng)味物質(zhì)分子結(jié)合來影響風(fēng)味物質(zhì)的擴散及保留[6，31]，風(fēng)味物質(zhì)與多糖的親和力越強，越容易發(fā)生相互作用，從而越容易得到保留。本試驗中由紅曲菌Z505發(fā)酵得到的胞外多糖為1.89 g/L，其感官評分也相對最高，表明多糖對香味物質(zhì)的保留以及擴散具有一定的正相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

紅曲菌產(chǎn)生的紅曲多糖可以影響風(fēng)味物質(zhì)的釋放，使飲料產(chǎn)品具有更好的感官品質(zhì)，紅曲菌發(fā)酵還能產(chǎn)生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亞油酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)賦予紅曲產(chǎn)品良好的風(fēng)味，除此之外，紅曲菌產(chǎn)生的紅曲黃色素、橙色素、紅色素，能夠賦予發(fā)酵飲料顏色，產(chǎn)生的monacolin K、γ-氨基丁酸等多種功能活性物質(zhì)賦予其功能性，紅薯是一種營養(yǎng)豐富的食品，所以利用紅曲菌發(fā)酵紅薯制備紅薯紅曲多糖飲料有一定的前景。

不同紅曲菌株產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力存在明顯差別，本研究對比分析 3 株紅曲菌（Z505、H4000、GN）液態(tài)發(fā)酵紅薯研制多糖飲料在pH值、紅曲色素、紅曲多糖、桔霉素以及感官評分的差異性，結(jié)果表明3株紅曲菌發(fā)酵結(jié)束時的pH值無明顯差異，紅曲菌株Z505產(chǎn)紅曲多糖的能力最強，為1.89 g/L，桔霉素含量最低，發(fā)酵上清液色澤橙黃透亮，感官評分最好，散發(fā)著花果香味，適合進一步用于紅薯紅曲多糖飲料方面的研制。