高巖松，王超，高磊，楊舸，趙玉娟，趙子健，牛春華，李盛鈺

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，吉林長春 130033）

益生菌是一類對宿主健康有促進(jìn)作用的活微生物，主要包括乳桿菌和雙歧桿菌。益生菌通常用于乳制品中，包括酸奶、奶酪和冰淇淋等。干酪是益生菌的良好載體，益生菌添加到干酪中，除了可以提高益生菌的存活能力，還能增加干酪貯藏過程中的酸化，并有利于改善干酪的質(zhì)地和豐富干酪的口感、風(fēng)味等[1]。另外，一些功能性益生菌還能賦予干酪健康促進(jìn)作用[2]。目前，益生菌已成功融入不同的干酪品種中，如切達(dá)干酪、高達(dá)、奶油干酪等。益生菌干酪（Probiotic Cheese）已成為功能食品重要的發(fā)展方向。

Ricotta 干酪是最受歡迎和最古老的乳清干酪品種[3]。它是一種質(zhì)地柔軟、口味溫和的非成熟干酪。傳統(tǒng)上，Ricotta 干酪是通過加熱乳清并用乳酸酸化凝固乳清蛋白來制備的，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)的共沉淀原理。Ricotta 被認(rèn)為是一種健康食品，其脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量豐富，又含有多種礦物質(zhì)和水溶性維生素。近年來，在Ricotta 干酪加工技術(shù)、品質(zhì)改良和新產(chǎn)品開發(fā)等方面不斷取得新的研究進(jìn)展[4-6]。而在最近，一些益生菌，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（L.casei）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）和動物雙岐桿菌（B.animalis）等應(yīng)用于Ricotta 干酪中，開展了益生菌Ricotta 干酪流變學(xué)、質(zhì)構(gòu)、微觀結(jié)構(gòu)和風(fēng)味等方面的研究，并開發(fā)了益生菌Ricotta 干酪產(chǎn)品[7-9]。作為益生菌的載體，乳清干酪與其他食品相比可能更具有優(yōu)勢，因?yàn)槿榍甯衫揖哂邢鄬^高的水分含量、較高的pH 值、較低的鹽含量和較低的含氧量，這些特性可能為益生菌提供更好的保護(hù)。但在乳清干酪基質(zhì)中添加益生菌可能會對干酪的質(zhì)構(gòu)、感官和風(fēng)味等產(chǎn)生不利影響。因此，開展符合益生菌乳清干酪加工要求的優(yōu)良益生菌的篩選、評價(jià)和應(yīng)用研究就變得尤為重要。然而，目前這方面的研究還有待深入。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）AS185 由自然發(fā)酵農(nóng)家黃豆醬中分離獲得，菌種保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏編號：CCTCC NO:M 2018114）。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，AS185 菌株具有調(diào)節(jié)血脂、降低炎性粘附分子和炎性因子水平，能有效預(yù)防和減輕大鼠早期動脈粥樣硬化，是一株有應(yīng)用前景的功能益生菌新菌株[10]。本研究開發(fā)一款添加AS185 的益生菌Ricotta 干酪新產(chǎn)品，評價(jià)了AS185作為功能益生菌和附屬發(fā)酵劑對干酪理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)、風(fēng)味發(fā)展和益生菌存活的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清，本實(shí)驗(yàn)室加工哈羅米干酪產(chǎn)生的副產(chǎn)物乳清水（蛋白質(zhì)含量為0.85%、脂肪含量為0.53%、pH值為6.6）；無水檸檬酸（食品級），河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

改良M17 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，酵母膏2.5，磷酸甘油二鈉10.0，硫酸鎂0.25，異抗壞血酸鈉0.5，瓊脂粉20.0，pH 值7.1～7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3780 高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo 公司；BCN-1360B 無菌超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HZQ-Q 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Sorvall Evolotion RC 高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo 公司；HYCV-407 干酪槽，黑龍江赫益乳業(yè)科技有限公司；Testo205 pH 計(jì)，德國Testo 公司；TA.XT plus 物性分析儀，英國 Stable Micro Systems公司；GC-MS 6890N-5875B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司。

1.3 菌株及培養(yǎng)方法

乳酸片球菌（P.acidilactici）AS185 凍存菌株在改良M17 液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化傳代3 次后，按3%（V/V）接種量接種于改良M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，離心（4 000 r/min，4 ℃，10 min），棄上清，菌體沉淀用滅菌生理鹽水洗滌2 次，離心（5 000 r/min，4 ℃，10 min），用滅菌PBS 溶液（pH 值7.2）洗滌沉淀的菌體2 次，重懸于PBS 溶液中，調(diào)整菌液濃度為1.0×1010CFU/mL，4 ℃冰箱保存，備用。

1.4 干酪制作工藝及操作要點(diǎn)

乳清干酪制作參考Sameer 等[9]的方法進(jìn)行，具體工藝流程略有調(diào)整（圖1），加工工藝要點(diǎn)如下：

圖1 益生菌乳清干酪制備流程圖Fig.1 Flow chart for preparation of probiotic Ricotta cheese

（1）乳清加熱：以哈羅米干酪加工的副產(chǎn)物乳清為原料，將其加熱至70 ℃；

（2）原料乳處理及添加：將生牛乳進(jìn)行巴氏殺菌處理（63 ℃，30 min），然后按乳清水:殺菌乳=9:1（V/V）的比例添加至乳清水中；

（3）加熱處理：將混有巴氏殺菌乳的乳清加熱至90 ℃，保持15 min 后冷卻至75 ℃；

（4）凝乳：將10%的檸檬酸溶液緩慢加入到乳清中，邊加邊攪拌，調(diào)整乳清pH 值5.4，至絮狀凝塊出現(xiàn)，靜置5 min；

（5）凝塊收集：用尼龍濾布（80 目）排出乳清，收集凝塊；

（6）益生菌添加：向乳清干酪凝塊中添加乳酸片球菌AS185菌懸液，使凝塊中活菌數(shù)達(dá)到8 log CFU/g，對照組乳清干酪不添加益生菌

（7）拌鹽：按乳清干酪凝塊重量的1.5%添加無碘食用鹽，并攪拌均勻；

（8）壓制成型：將乳清凝塊裝入模具中，于7 ℃進(jìn)行壓制處理，0.2 MPa，20 h。

（9）包裝與貯存：成型后的乳清干酪用單向透氣膜進(jìn)行真空包裝，4 ℃貯存。

1.5 理化指標(biāo)測定

取4 ℃貯存21 d 的對照干酪和益生菌干酪樣品用于一般理化指標(biāo)檢測。脂肪含量測定采用GB 5009.6-2016；蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5-2016；水分含量測定采用GB 5009.3-2016；pH 值采用Testo205 pH 計(jì)插入干酪樣品直接測定。

1.6 貯存期益生菌穩(wěn)定性測定

分別在于第0 天、第7 天、第14 天和第21 天取益生菌乳清干酪樣品10 g，加入2%無菌檸檬酸鈉溶液90 mL，充分均漿，用滅菌生理鹽水倍比稀釋，涂布于改良M17 固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果以log CFU/g 計(jì)。

1.7 貯存期質(zhì)構(gòu)測定

分別于第0 天、第7 天、第14 天和第21 天取乳清干酪樣品，切成邊長為1.5 cm 的立方塊，室溫放置20 min 后，利用TA.XT plus 物性分析儀進(jìn)行TPA 參數(shù)測定。測量模式：探頭選擇P 0.5，測量前探頭下降速度為1.0 mm/s；測試速度為1.0 mm/s，測量后探頭回程速度為10.0 mm/s，目標(biāo)模式設(shè)置為壓力，壓力選擇10%，下壓變形時間為10.0 s，觸發(fā)力為2 g。

1.8 揮發(fā)性成分的測定

采用HS-SPME-GC-MS（6890N-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）對貯存21 d 的乳清干酪樣品進(jìn)行測定。前處理方法：稱取適量樣品置于頂空瓶中，密封，在80 ℃水浴中平衡30 min，進(jìn)行萃取處理，結(jié)束后，用萃取針在進(jìn)樣口解吸5 min。色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；載氣流量1.0 mL/min；分流比：不分流；掃描方式：Full Scan。升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升至180 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持5 min。采集到的質(zhì)譜圖利用NIST 譜庫進(jìn)行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.9 感官評定

在乳清干酪成熟21 d 時進(jìn)行感官評定。邀請20名從事食品研究的人員組成評定小組，對干酪的外觀色澤、滋、氣味和組織狀態(tài)進(jìn)行感官評定。評定細(xì)則參照白建等[11]的方法進(jìn)行，詳細(xì)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The standard of sensory evaluation

1.10 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行5 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件作圖；采用CANOCO 4.5 軟件對理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)參數(shù)、感官指標(biāo)和主要揮發(fā)性成分采用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 益生菌乳清干酪理化指標(biāo)分析

由表2 可以看出，經(jīng)21 d 的貯存后，益生菌乳清干酪中的脂肪、蛋白質(zhì)和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.60%、27.47%和49.95%，pH 值為4.75，與對照組乳清干酪在脂肪、蛋白質(zhì)、水分含量及pH 值方面均無顯著差異（p＞0.05），說明添加乳酸片球菌AS185 并不會對乳清干酪的理化指標(biāo)產(chǎn)生影響。這也與之前Meira 等[7]和Kisan 等[8]報(bào)道的結(jié)果一致，益生菌的添加并不會影響乳清干酪的脂肪和蛋白質(zhì)的總體含量變化。

表2 乳清干酪理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical characteristics of whey cheese

2.2 益生菌乳清干酪貯存期間微生物活菌數(shù)的變化

連續(xù)3 周定期對益生菌乳清干酪中的活菌數(shù)進(jìn)行了監(jiān)測，結(jié)果如圖2 所示。隨貯存期的延長，益生菌乳清干酪中活菌數(shù)呈下降趨勢，第21 d 時，活菌數(shù)由最初的8.17 lg CFU/g 降至為7.45 lg CFU/g，僅降低不到1 個數(shù)量級，說明AS185 菌株在干酪中能保持較高的存活率。而生產(chǎn)益生菌干酪的一個前提是在較長的干酪成熟期和儲存中能夠充分存活，這是選擇干酪用益生菌菌株時考慮的一個重要因素。普遍接受的益生菌食品的益生菌活菌數(shù)不低于6.0 lg CFU/g。許多研究已經(jīng)在不同類型的干酪中加入了益生菌，如切達(dá)干酪、Cottage 干酪和新鮮干酪等，大多數(shù)干酪都較好地保持了益生菌的存活能力，甚至有的益生菌干酪還增加了益生菌活菌數(shù)[12]。這些結(jié)果證實(shí)了干酪是一種很好的益生菌載體。

圖2 益生菌乳清干酪貯存期間乳酸菌活菌數(shù)的變化Fig.2 Changes in viable counts of probiotic whey cheese during storage

2.3 益生菌乳清干酪質(zhì)構(gòu)特性的分析

連續(xù)3 周定期對乳清干酪的質(zhì)構(gòu)特性變化進(jìn)行了監(jiān)測，結(jié)果如圖3 所示。在第0 天時，益生菌乳清干酪的硬度、粘聚性、膠著度、咀嚼度和回復(fù)性均高于對照乳清干酪，彈性低于對照乳清干酪。隨貯存期的延長，益生菌乳清干酪和對照組干酪的硬度、咀嚼度和膠著度在逐漸增加，彈性、粘聚性和回復(fù)性在逐漸降低。隨干酪貯存時間延長，兩組干酪的硬度均增加明顯，Souza 等[13]報(bào)道含有嗜酸乳桿菌的Minas frescal干酪在貯藏過程中變硬。這可能與貯存期間乳清干酪水分含量降低有關(guān)[14]。貯存21 d，益生菌乳清干酪的硬度為723.85 g，略高于對照組干酪，但組間差異不顯著。有研究指出[15]，優(yōu)于添加益生菌，巴西半硬質(zhì)羊奶干酪（Coalho）在存儲過程中酸化增加，導(dǎo)致益生菌干酪的硬度高于對照干酪。而本研究雖然在Ricotta 干酪中添加了益生菌AS185，但由于貯存期較短，益生菌干酪與對照組干酪相比pH 值變化不明顯（表2），導(dǎo)致兩組干酪的硬度差異不顯著。

圖3 乳清干酪貯存期的質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化Fig.3 Changes in texture parameters of whey cheese during storage

2.4 益生菌乳清干酪揮發(fā)性成分分析

由表3可以看出，對照乳清干酪檢測出11類成分，益生菌乳清干酪檢測出15 類成分。對照乳清干酪檢測出的揮發(fā)性成分中主要類別有烯烴類和酸類，相對含量分別為31.03%，22.20%；益生菌乳清干酪檢測出的揮發(fā)性成分中占主要類別有酸類、醇類、酮類，相對含量分別為38.56%、24.64%、13.76%。兩者類別中烯烴類、醇類、酮類、酸類相對含量差別較大。烴類化合物主要來源于原料乳清，他們的閾值相對較高，對干酪整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[16]。醇類化合物能與脂肪酸進(jìn)一步形成酯，所以能間接對風(fēng)味產(chǎn)生作用。本研究中，對照乳清干酪中檢測出2 種醇類化合物，相對含量7.48%；益生菌乳清干酪中檢測出8 種醇類化合物，相對含量24.64%。醇類化合物種類和相對含量明顯高于對照組，其產(chǎn)生的原因主要包括：一是與添加益生菌有關(guān)；二是干酪生化反應(yīng)途徑中的脂肪酶對干酪中的脂肪酸進(jìn)行降解生成醇類化合物；三是乙醇主要由乳糖代謝中磷酸戊糖途徑生成[17]。另外，醇類化合物還能夠以氨基酸、乳糖、甲基酮還原等代謝途徑進(jìn)行合成。其中2,3-丁二醇可以賦予干酪水果味。郝曉娜等[18]報(bào)道了添加植物乳桿菌的干酪醇類化合物種類多于對照組，且賦予干酪水果香味和酒香味。酮類化合物對于干酪的風(fēng)味具有重要的影響，益生菌乳清干酪的酮類化合物相對含量明顯高于對照組干酪，苗君蒞等[19]研究結(jié)果也證實(shí)了，添加植物乳酸桿菌的干酪，酮類化合物3-羥基-2-丁酮和2-丁酮的濃度明顯高于對照組。短鏈脂肪酸較低的閾值保證了干酪的典型發(fā)酵風(fēng)味，且每一種短鏈脂肪酸都有自己獨(dú)特的味道。益生菌乳清干酪短鏈脂肪酸類化合物相對含量顯著高于對照組。主要是由益生菌AS185 代謝產(chǎn)生的，且主要相對含量增加的的化合物為乙酸、辛酸、正癸酸。其中乙酸可以賦予干酪醋味，而辛酸賦予清香味和淡淡的水果酸氣味。

表3 乳清干酪揮發(fā)性成分相對含量比較Table 3 Comparison of relative contents of volatile components in whey cheeses

2.5 感官評定

乳清干酪貯存21 d 后的感官評定結(jié)果如表4 所示。益生菌乳清干酪在外觀色澤、滋氣味和組織狀態(tài)和總分方面的分值均略高于對照乳清干酪，但與對照組比較差異不顯著（p＞0.05）。添加益生菌的干酪至少應(yīng)該保持和顯示原有干酪的風(fēng)味屬性。益生菌對干酪風(fēng)味特性的影響主要取決于益生菌的種類和添加的菌株。此外，它還取決于菌株在干酪生產(chǎn)和儲存過程中的代謝活動。許多研究表明，向干酪中添加益生菌并不會顯著改變最終產(chǎn)品的風(fēng)味和/或其他感官特性。例如，Papadopoulou 等[20]報(bào)道添加植物乳桿菌（L.plantarum）T571 的希臘Feta 干酪其感官特性與對照干酪相當(dāng)，表明添加乳酸菌對感官標(biāo)準(zhǔn)沒有不良影響。此外，Stanton 等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，在切達(dá)干酪中添加了副干酪（L.paracasei）也得到了同樣的結(jié)果。本研究的感官評定結(jié)果來看，所添加的益生菌乳酸片球菌AS185 不影響乳清干酪的整體感官特性。也有一些研究報(bào)道，在干酪中添加益生菌會降低產(chǎn)品的感官（尤其是風(fēng)味）可接受性，Ong 等[22]的研究表明，添加干酪乳桿菌和ABC 培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌4962、B.longum1941 和干酪乳桿菌279）的干酪接受分?jǐn)?shù)最低。Gomes 等[23]也發(fā)現(xiàn)添加嗜酸乳桿菌的Minas 新鮮干酪在外觀、香味和質(zhì)地方面得分較低，這與其pH值較低以及微生物的代謝產(chǎn)生大量的有機(jī)酸有關(guān)。

表4 乳清干酪感官評定Table 4 Sensory evaluation of whey cheese

2.6 乳清干酪理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)參數(shù)、感官評定與主要揮發(fā)性成分RDA 分析

通過RDA 分析考察了對照組和益生菌組乳清干酪的理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)、感官及揮發(fā)性成分的相關(guān)性。結(jié)果表明（圖4），對照組乳清干酪與益生菌乳清干酪呈現(xiàn)分散趨勢，提示了乳酸片球菌AS185 的添加可以使得乳清干酪的理化性質(zhì)產(chǎn)生明顯變化。在理化性質(zhì)分析中，益生菌的添加與干酪的咀嚼度、膠著度和硬度呈正相關(guān)，而與水分、pH 值、滋氣味、彈性、粘聚性和感官評定總分不呈現(xiàn)相關(guān)性。在揮發(fā)性成分分析中，乳酸片球菌AS185 的添加與酯類、酸類、醛類、酮類、醇類和醚類等揮發(fā)性成分的含量具有相關(guān)性，其中以酯類最為顯著，而與胺類、烷烴類和烯烴類呈現(xiàn)的相關(guān)性較小。上述結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了乳酸片球菌AS185 可以顯著改善干酪的質(zhì)構(gòu)，并促進(jìn)酯類揮發(fā)性成分的增加，同時揭示了乳酸片球菌AS185 的添加促進(jìn)了干酪的口感和風(fēng)味的提升。

圖4 乳清干酪理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)參數(shù)、感官評定與主要揮發(fā)性成分RDA 分析Fig.4 Physicochemical indexes,texture parameters,sensory evaluation and RDA analysis of main volatile components of whey cheese

3 結(jié)論

綜上所述，本研究將一株益生性乳酸片球菌AS185 應(yīng)用于Ricotta 干酪加工，開發(fā)了一款含功能性益生菌的乳清干酪。添加乳酸片球菌AS185 不影響Ricotta 乳清干酪的理化指標(biāo)和質(zhì)構(gòu)特性；AS185 菌株在干酪貯存期內(nèi)保持較高的活菌數(shù)；AS185 菌株有助于促進(jìn)乳清干酪風(fēng)味的形成，其中酸類、醇類、酮類的相對含量均高于對照組；益生菌添加對干酪外觀色澤、滋氣味和組織狀態(tài)方面無顯著影響，但整體可接受性方面優(yōu)于對照干酪。益生菌乳酸片球菌AS185 的添加對Ricotta 干酪品質(zhì)提升有積極作用。因此，乳酸片球菌AS185 是一株在益生菌乳清干酪生產(chǎn)中有應(yīng)用前景的菌株。