李詩瑤,彭青枝,王鳴秋,劉艷 ,董婉婷
(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院,國家市場監(jiān)管重點實驗室(動物源性食品中重點化學危害物檢測技術(shù)),湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430075)(2.武漢軟件工程職業(yè)學院,湖北武漢 430205)
食源性病原菌是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細菌,其入侵宿主并具有致病性。常見的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、結(jié)核菌等[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)提供的數(shù)據(jù),全世界每年有近200 萬人死于食源性病原體引起的腸道疾病[2]?,F(xiàn)階段,食源性致病菌的主要檢測方法有培養(yǎng)法、生化鑒定及聚合酶鏈式反應(yīng)法等[3-5],其中培養(yǎng)法是黃金標準方法[1],需要進行增菌、分離、鑒定等多個步驟,耗時長,具有一定的局限性。即使經(jīng)過選擇性增菌培養(yǎng)后,致病菌的快速檢測仍然受到培養(yǎng)基成分、食品成分等影響[6-9]。因此,選擇合適的分離富集方法使低濃度靶細菌能從食品基質(zhì)中分離出來且減少食品成分對檢測方法的干擾,對實現(xiàn)靶細菌快速、靈敏的檢測顯得尤為重要。
磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)因其比表面積大,具有良好的生物相容性且具有超順磁性等特點,為在食品基質(zhì)中快速吸附分離致病菌提供了一種解決方案[10-12]。氨基化磁珠(N-MNPS)是在Fe3O4MNPs 表面修飾了大量氨基,在pH 值為5~9的條件下,其表面電荷為正電荷,與裸磁珠相比帶正電荷的納米粒子與細菌間的相互作用更強,更容易吸附細菌[13]。本研究基于表面帶正電荷的(N-MNPS)與表面帶負電荷的細菌間的靜電相互作用,無需在MNPs 表面修飾特異性識別元件,省去了復雜的生物偶聯(lián)步驟,減少了制備成本;因為對細菌不具有特異性,因此能對幾乎所有帶負電細菌都有吸附捕獲作用,當食源性疾病爆發(fā)時,可用N-MNPS 富集樣品中所有類型的病原菌實現(xiàn)非把向檢測,可以避免漏檢導致的陰性結(jié)論,下游可結(jié)合多重檢測手段,實現(xiàn)對多種食源性致病菌同步檢測,提高檢測效率[14]。本研究通過一系列優(yōu)化確定了氨基化磁珠的最佳吸附條件,并初步驗證了在模擬添加食品樣品中其對常見食源性病原菌的吸附效果,為下游多重檢測奠定了基礎(chǔ)。
1.1.1 實驗菌種
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538、單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19115、大腸埃希氏菌O157:H7(Escherichia coliO157:H7),均購自美國菌種保藏中心。
1.1.2 主要試劑
腦心浸液(Brain Heart Infusion,BHI)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽平板(Xylose Lysine Deoxycholate,XLD)、Baird-Parker(Baird-parker agar,BP)瓊脂培養(yǎng)基、單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基(Listera Chromogenic Medium,LC)、大腸埃希氏菌O157 顯色培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS),均購自北京陸橋;氨基化磁珠(NH2-magnetic Nanoparticles,N-MNTPs),粒徑分別為1 μm、300 nm、100 nm,均購自海貍生物;其他分析試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。
BSC-1600Ⅱ A2二級生物安全柜,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Heratherm IGS400 生化培養(yǎng)箱,美國Thermo Fisher Scientific Inc;ZQTY-70F 臺式全溫振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;SX-700 壓力蒸汽滅菌器,日本TOMY 公司;ST40R 離心機,美國Thermo Fisher Scientific Inc;wi114629 麥氏比濁儀,梅里埃中國有限公司;磁力架,上海奧潤微納新材料科技有限公司。
1.3.1 菌種培養(yǎng)及制備
用接種環(huán)分別從培養(yǎng)基斜面(保存在4 ℃的冰箱)挑取實驗菌株Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 至BHI 溶液中,隨后于振蕩培養(yǎng)箱36 ℃,120 r/min 培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)得到的菌液5000 r/min 離心10 min,然后將離心后的沉淀菌體用10 mmol/L、pH 值7.4 的無菌PBS 緩沖液洗滌三次,離心收集菌體,重懸于5 mL PBS 緩沖液中。通過麥氏比濁儀制備102~108CFU/mL 的菌液。
1.3.2 不同pH 緩沖液中N-MNPS 以及病原菌zeta 電位測定
細菌的表面電位遵循大島軟粒子理論,其表面電位取決于細菌電荷密度和膜結(jié)構(gòu)[15]。根據(jù)四種細菌的最適生長pH范圍,用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將10 mmol/L PBS 分別調(diào)節(jié)至pH 值:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。通過測定不同pH 值細菌菌懸液以及三種粒徑(100 nm、300 nm、1 μm)N-MNPS 的zeta電位值來對細菌與N-MNPS 靜電結(jié)合進行評估。
1.3.3 N-MNPS的用量對四種病原菌捕獲率的影響
分別取不同量的N-MNPS(1 mg/mL)5、10、20、30、50、75、100、125、150、175、200 μg 于2 mL離心管中,磁分離后棄上清,分別加入1 mL 103CFU/mL 四種菌的新鮮菌液,在振蕩培養(yǎng)箱36 ℃,120 r/min下溫育60 min,混合均勻后磁分離N-MNPS,吸取上清液0.1 mL 分別涂布于XLD、BP、LC、大腸桿菌O157 顯色平板上,同時將未使用N-MNPS 捕獲的菌液同步溫育,作為初始加入的總菌量,每組實驗設(shè)置3 個平行,培養(yǎng)結(jié)束后,進行捕獲率的計算。
捕獲率計算公式:
式中:
X——捕獲率,%;
D——上清液中的菌落數(shù),CFU;
D0——未磁捕獲的總菌落數(shù),CFU。
1.3.4 N-MNPS 的吸附時間對四種病原菌捕獲率的影響
于2 mL 離心管中,分別加入1 mL 103CFU/mL四種菌的新鮮菌液,添加由1.3.3 計算出捕獲率最高的N-MNTPs 添加量,孵育5、10、20、30、45、60、90 min 后,磁吸取上清,同時將未使用N-MNPS 捕獲的菌液同步溫育,依照1.3.3 的溫育條件及公式進行捕獲率的計算。
1.3.5 單菌正交實驗
根據(jù)四種病原菌的單因素實驗結(jié)果,選用L9(33)正交表,以磁珠粒徑,磁珠用量,吸附時間為考察因素,進行3 因素3 水平的正交實驗,選取1.5 mL 濃度為103CFU/mL 的各菌液進一步優(yōu)化捕獲的條件。因素水平表如表1 所示。
表1 單菌正交實驗因素水平表Table 1 Levels and factors to orthogonal test in individual bacteria
1.3.6 混菌單因素實驗
依據(jù)1.3.5 單菌正交試驗的結(jié)果設(shè)計混菌單因素實驗,選出最適宜在該條件下混合的目標菌,設(shè)計條件盡量覆蓋所有目標菌。分別吸取0.5 mL 103CFU/mL各菌液至2 mL 離心管充分混勻,單因素磁珠添加量為10、25、50、75、100、150、175、200 μg 孵育60 min,使用最優(yōu)添加量,單因素孵育時間5、10、20、30、45、60、90 min,依照1.3.3 的溫育條件及公式進行捕獲率的計算。
1.3.7 大體積中N-MNTPs 對混菌的捕獲效率
根據(jù)1.3.6 的小體系中最優(yōu)實驗結(jié)果,設(shè)計在10、50 mL 的PBS 中,平均添加三種菌液使混合菌液濃度至103、102CFU/mL,計數(shù)結(jié)果依照1.3.3 的溫育條件及公式進行捕獲率的計算。
1.3.8 實際樣品中N-MNTPs 的捕獲效率
取牛奶、水果沙拉各5 份,勻漿后分裝為5 g 每份,向100 mL 錐形瓶中分別加入5 g 樣品和45 mL PBS,于121 ℃滅菌15 min 后冷卻至室溫,加入目標病原菌菌液,使得樣品中病原菌混菌終濃度為 1 02~106CFU/mL(g)。以1.3.6 的最優(yōu)結(jié)果進行試驗,依照1.3.3 的溫育條件及公式進行捕獲率的計算。
1.3.9 統(tǒng)計與分析
本文中所有捕獲率實驗平行三次。運用SPSS Statistics 26 軟件統(tǒng)計,對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析(p<0.05)。
Zeta 電位可以監(jiān)測出不同緩沖體系中細菌表面的帶電荷數(shù)、N-MNTPs 表面的帶電荷數(shù)。不同pH 值條件下各細菌的Zeta 電位值結(jié)果見圖1。金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌在pH 值4~11 之間Zeta電勢值均低于-40 mV,沙門氏菌在pH 值6~11 之間低于-10 mV,大腸桿菌O157:H7 在pH 值5~11 之間電勢低于-5 mV。由圖2 可以看出N-MNPS 在pH 值2~7之間處于20 mV,在pH 值8~11 時電勢值下降在pH值9~11 電勢值為負值。由此可以得出四種菌在pH 值2~11 之間,表面均帶負電荷。如圖2 可知,三種粒徑的N-MNPS 在pH 值2~9 時,表面均帶正電荷,所以吸附環(huán)境在pH 值2~9 時對帶負電荷的細菌靜電吸附能力會更強,考慮到大部分病原菌最適生長pH 值7.2~7.6,為保證活菌數(shù)量,選擇pH 值7.4 作為后續(xù)實驗體系的pH 值。
圖1 不同pH 條件下各細菌的Zeta 電位值Fig.1 Zeta potential of bacteria under different pH conditions
圖2 不同pH 條件下N-MNPS 的Zeta 電位值Fig.2 Zeta potential of N-MNPS under different pH conditions
由圖3 可以看出在1 mL 103CFU/mL 的各菌液中加入不同量的N-MNPS,四種菌在N-MNPS 添加量為100 μg 時,捕獲率均可達到70%以上,其中除了大腸埃希氏菌O157:H7,其余三種菌均可在磁珠添加量為75 μg 時捕獲率達到70%以上。以100 μg 添加量作為最優(yōu)條件對孵育時間進行優(yōu)化,如圖4 可以看出沙門氏菌在孵育時間為5 min 捕獲率就可以達到90%以上,金黃色葡萄球菌和大腸O157:H7 在45 min 時能達到80%,單核細胞增生李斯特菌在45 min 時捕獲率為66%。正交試驗顯著性分析沙門氏菌:粒徑有顯著影響(p<0.05),因素主次順序為粒徑>時間>添加量;金黃色葡萄球菌:三因素均無顯著影響(p>0.05),因素主次順序為粒徑>添加量>時間;單核增生李斯特菌:粒徑有顯著影響(p<0.05),因素主次順序為粒徑>時間>添加量,大腸埃希氏菌O157:H7 粒徑有顯著影響(p<0.05),因素主次順序為粒徑>時間>添加量,單菌體系中正交實驗極差分析最優(yōu)結(jié)果見表3。綜合正交結(jié)果,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌三者磁珠吸附的最優(yōu)粒徑均為300 nm,大腸埃希氏菌O157:H7 的最優(yōu)粒徑為1 μm,為保證富集病原菌的多樣性,后續(xù)試驗使用300 nm 的N-MNPS富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌的混合菌液進行捕獲。
圖3 單菌體系中N-MNPS 用量對捕獲率的影響Fig.3 Effect of N-MNPS dosage on capture rate in single bacteria system
圖4 單菌體系中孵育時間對捕獲效率的影響Fig.4 Effect of incubation time on capture efficiency in single bacteria system
表2 正交實驗極差分析最優(yōu)結(jié)果Table 2 The optimal results of range analysis to orthogonal test
在1.5 mL 混菌體系中加入不同量300 nm 粒徑的N-MNTPs,不同孵育時間,結(jié)果如圖5、圖6。當磁珠添加量為50 μg,孵育60 min,三種混菌吸附率分別可達到90%以上;即使在添加量為50 μg,孵育30 min 三種混菌吸附率分別可達60%以上。證明在沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌三種菌的混合體系中,菌體之間并未對捕獲率造成很大影響,混合菌體的捕獲率達到預期(≥50%)。
圖5 合菌體系中磁珠添加量對捕獲效率的影響Fig.5 Effect of adding amount of magnetic beads on capture efficiency in mixed bacteria system
圖6 合菌體系中孵育時間對捕獲效率的影響Fig.6 Effect of incubation time on capture efficiency in mixed bacteria system
依據(jù)2.3 的結(jié)果,選取300 nm 粒徑、50 μg 每1.5 mL添加量、60 min孵育時間作為大體積實驗條件。根據(jù)反應(yīng)體系的倍數(shù)增大將磁珠添加量提高至500 μg,孵育60 min,分別在10、50 mL 無菌PBS 中,平均添加的混合菌液使其終濃度為103、102CFU/mL。結(jié)果如圖7 所示,混合菌液濃度為103CFU/mL 時,隨著反應(yīng)體系體積的加大,成倍數(shù)加大投入磁珠的量,沙門氏菌捕獲率為60%左右,金黃色葡萄球菌的捕獲率為75%左右,單核細胞增生李斯特氏菌在反應(yīng)體系為50 mL 時,捕獲率由80%下降至70%;混合菌液濃度為102CFU/mL 時各菌的捕獲率也均可達到55%以上。由此得出,大體積的反應(yīng)體系與小體積反應(yīng)體系,在磁珠投入量與反應(yīng)體系體積比例不變的情況下捕獲效率影響并未受到明顯影響。證明該優(yōu)化后的條件可應(yīng)用至50 mL 的樣品前處理稀釋液中。
圖7 在10 mL 與50 mL 體系中混菌終濃度為103(a)與102(b)時的捕獲率Fig.7 The capture rate at the final concentration of 103 (a) and 102 (b) in 10 mL and 50 mL systems
牛奶、水果沙拉實際樣品中三種病原菌混菌終濃度為102~106CFU/mL(g),加入N-MNTPs 進行捕獲。牛奶中混菌的濃度在1×102~1×105CFU/mL 時捕獲率從48%~70%逐步增加,在混菌終濃度為1×106CFU/mL時,捕獲率下降至50%~60%,在水果沙拉中,混菌終濃度在1×102~1×105CFU/mL 時捕獲率從64%~78%逐步增加,在混菌終濃度為1×106CFU/mL 時,捕獲率下降至65%~73%。結(jié)果如圖8 所示,N-MNTPs 對牛奶和水果沙拉中的病原菌捕獲效率均大于48%。水果沙拉的基質(zhì)相比較于牛奶的基質(zhì)更為復雜,理論上捕獲率應(yīng)低于牛奶基質(zhì),但是捕獲率更優(yōu),證明在食品基質(zhì)中N-MNTPs 捕獲效果較好。
圖8 人工污染牛奶(a)和水果沙拉(b)中各菌的捕獲率Fig.8 Capture rate of bacteria in artificially contaminated milk(a) and fruit salad (b)
本探究基于N-MNPS 在pH 值為2~9 范圍內(nèi)帶正電荷,與表面帶負電荷的細菌存在靜電吸附作用,確立了在Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes三種食源性致病菌菌的混合菌液體系中N-MNPS 對于這三種菌的吸附條件,并將其應(yīng)用至實際食物樣本牛奶以及蔬菜沙拉中。研究初步證實,N-MNPS 的吸附效果于細菌本身是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性細菌無直接關(guān)聯(lián),通過對細菌的不同pH 值下表面帶電情況的研究,側(cè)面證明N-MNPS與細菌間存在很強的靜電吸附,同樣的結(jié)果研究結(jié)果也在孫程[16]的研究中被證實,在pH 值為4~8 時對Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes、Escherichia.coliO157:H7 的捕獲效率大于70%,100 μg的氨基功能化磁性納米粒子對102~106CFU/mL 的菌液濃度捕獲率菌高于85%。本實驗表明,在50 mL 的混菌體系(Salmonella typhimurium、Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes)中,加入550 μg、粒徑300 nm的N-MNPS,在孵育60 min時,最低可捕獲1×102CFU/mL各菌,捕獲效率>50%。對人工污染的牛奶、水果沙拉進行目標菌捕獲,在混合菌終濃度為1×102CFU/mL時也可達到40%以上的捕獲率,捕獲效率較好。捕獲后的細菌提取DNA 可滿足下游熒光PCR 檢測的檢出限要求,免去了繁瑣耗時的培養(yǎng)增菌的過程,為后續(xù)食品中食源性致病菌的快速檢測奠定基礎(chǔ)。