錢冠林，孫 敬，劉 微，程 嬌，岳喜慶，鄭 艷

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳是八大過敏原之一，世界范圍內(nèi)牛乳過敏的患者占食物過敏患者的2.0%～7.5%[1]，其中嬰幼兒占過敏總?cè)藬?shù)的2.69%[2]。牛乳過敏主要由酪蛋白（casein，CN）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）引起[3]，研究表明牛乳過敏人群有65%對CN過敏[4]，82%對β-Lg過敏[5]，超過50%的患者對α-La過敏。另有30%～35%的牛乳過敏患者對含量較低的牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）過敏[6-7]。牛乳蛋白過敏導致哮喘、濕疹以及消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等過敏癥狀[8]。

近年來，降低牛乳致敏性的方法主要有物理法、化學法及生物法[9]，但這些方法存在破壞牛乳營養(yǎng)成分、成本過高、條件難以控制或者引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變等缺陷，對牛乳的色澤與風味產(chǎn)生影響[10]。酶法具有作用條件溫和、高效、來源廣泛等特點[11]。蛋白酶可以切斷致敏蛋白肽鍵成為小分子肽段，破壞致敏蛋白的線性結(jié)構(gòu)，或改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，破壞構(gòu)象型表位，從而達到降低牛乳致敏性的目的。目前對酶法降低單一牛乳蛋白致敏性研究較多，對天然脫脂牛乳作為完整體系的脫敏研究較少；相比于單一酶解，雙酶法將從更多酶切位點裂解致敏乳蛋白，從而達到更好的脫敏效果，且對相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義[12]。

本研究以脫脂牛乳為研究對象，考察雙酶水解方式對其致敏性及品質(zhì)的影響，以期為低致敏乳制品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮脫脂牛乳 遼寧越秀輝山乳業(yè)集團有限公司；兔乳蛋白過敏血清由課題組自制；牛乳過敏患者血清池由中國醫(yī)科大學提供的8 例IgE水平較高患者血清等量混合后建立。

食品級堿性蛋白酶（酶活力105 466 U/g）、食品級風味蛋白酶（酶活力20 786 U/g） 丹麥Novozyme公司；羊抗兔IgG、鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid hydrate ammonium salt，ANS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA）、2-硝基苯甲酸 美國Genview公司；福林酚、甘氨酸 北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三(羥甲基)甲基甘氨酸（Tricine）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨、四甲基乙二胺 上海麥克林生化科技有限公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；生物素標記的羊抗人IgE抗體 美國KPL公司；溴化鉀（光譜級）、無水碳酸鈉、冰乙酸等常規(guī)試劑（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP萬分之一天平 北京賽多利斯公司；ICC basic IB R RO 15 ec恒溫水浴磁力攪拌器 德國IKA公司；Centrifuge 54308離心機 德國Eppendorf公司；UV2700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；STARTER2100 pH計 美國Ohaus公司；1645050蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；Amersham Imager 600凝膠成像儀 美國GE公司；S11P-250恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Eon酶標儀 美國BioTek公司；Nicolet 5DXC紅外光譜儀 美國Nicolet公司；F-4600熒光分光光度計日本日立公司；Zatasizer Nano Series納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝

根據(jù)課題組前期研究方法[13]：取脫脂牛乳150 mL（蛋白質(zhì)含量3.48 g/100 g）及堿性蛋白酶、風味蛋白酶溶液（均為100 mg/mL），預(yù)熱20 min（堿性蛋白酶（55±5） ℃，風味蛋白酶（50±5） ℃），在脫脂牛乳自然pH 6.65的條件下將蛋白酶溶液與脫脂牛乳按需混合，水浴90 ℃滅活10 min，冷卻至室溫，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清液4 ℃冷藏備用。

1.3.2 雙酶復合一步酶解條件的確定

1.3.2.1 雙酶添加量及配比的確定

固定酶解時間1 h，設(shè)置蛋白酶添加量分別為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，在堿性蛋白酶與風味蛋白酶配比（質(zhì)量比）為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的條件下考察其對脫脂牛乳水解度及分子質(zhì)量分布的影響，確定最適添加量和配比。

1.3.2.2 雙酶復合酶解時間的確定

在確定雙酶配比及添加量的基礎(chǔ)上，將酶解時間分別設(shè)定為20、40、60、80、100、120 min，考察酶解時間對脫脂牛乳水解度及酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響。

1.3.3 雙酶分步法酶解脫脂牛乳

確定雙酶復合添加量、配比和酶解時間后，考察雙酶分步處理對其水解度及分子質(zhì)量分布的影響，實驗條件設(shè)定見表1。

表1 雙酶分步法酶解脫脂牛乳方案Table 1 Schemes of one- and two-step hydrolysis of skimmed milk with Alcalase and Flavorzyme

1.3.4 水解度測定

使用OPA法測定酶解產(chǎn)物水解度[14]。取400 μL適當稀釋后的樣品置于離心管中，加入3.00 mL 0.8 mg/mL OPA溶液，振蕩混勻，精準反應(yīng)2 min后測定其OD340nm。使用精氨酸標準溶液繪制標準曲線。水解度按式（1）計算。

式中：c為由標準曲線得出的水解液中精氨酸濃度/（mmol/L）；c0為由標準曲線得出的未水解樣品中精氨酸濃度/（mmol/L）；n為樣品稀釋倍數(shù)；V為樣品總體積/L；m為樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；乳清蛋白中修正因子α、β分別為1.00、0.40；htot為總肽鍵數(shù)（8.8 mmol/g）。

1.3.5 分子質(zhì)量分布測定

根據(jù)Laemmli[15]的方法略作修改。采用Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）測定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，使用16%分離膠、10%夾層膠及4%濃縮膠，將未處理樣品與水解產(chǎn)物分別與等體積含DTT的4×Loading buffer混合，沸水中孵育10 min，2 000 r/min離心5 min，30 V條件下電泳1 h后轉(zhuǎn)為100 V繼續(xù)電泳2 h。電泳后的凝膠固定20 min，染色40 min，過夜脫色。

1.3.6 酶解產(chǎn)物IgG結(jié)合能力測定

體外競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法可以對酶解產(chǎn)物與特異性抗體IgG結(jié)合能力進行靈敏測定，根據(jù)孟軒夷[16]的方法，略作修改：1）抗原包被：取酶標板A，每孔加入100 μL碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）稀釋后的牛乳蛋白（脫脂牛乳10 μg/mL、CN 30 μg/mL、α-La 5 μg/mL、β-Lg 0.5 μg/mL），4 ℃孵育過夜；2）封阻：次日取出酶標板A，傾去包被液，使用300 μL PBST（含體積分數(shù)0.05%吐溫-20的PBS）對樣品孔洗滌5 min，共3 次，每個操作步驟后洗滌程序同此方法；使用250 μL 1 g/100 mL明膠溶液填充未飽和的酶標板A樣品孔，隨后在37 ℃條件下孵育1 h，另取酶標板B以相同方式封阻；3）樣品與抗體反應(yīng)：對酶標板B進行洗滌，每孔加入60 μL樣品，空白孔加入相同體積的PBS作為無競爭對照；在每個孔內(nèi)加入60 μL稀釋后的兔血清（樣品中加入血清稀釋倍數(shù)：脫脂牛乳、CN 1∶500，α-La 1∶7 000，β-Lg 1∶20 000），37 ℃孵育1 h；4）競爭反應(yīng)：對酶標板A的樣品孔進行洗滌，將酶標板B樣品孔內(nèi)的混合反應(yīng)物轉(zhuǎn)移100 μL至酶標板A，37 ℃孵育1 h；5）二抗反應(yīng)：對酶標板A樣品孔進行洗滌，每孔加入100 μL稀釋后的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG（樣品中加入IgG稀釋倍數(shù)：CN 1∶10 000；α-La、β-Lg 1∶5 000），37 ℃孵育1 h；6）顯色：洗滌酶標板A樣品孔，加入100 μL OPD底物緩沖液，于37 ℃避光孵育15 min；7）終止：每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；8）比色：測定490 nm波長處的吸光度。IgG抑制率按式（2）計算。

式中：A為待測樣品孔的吸光度；A0為無競爭組的吸光度。

1.3.7 酶解產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力測定

酶解產(chǎn)物與牛乳過敏患者血清中IgE結(jié)合能力是表征體內(nèi)過敏反應(yīng)強弱的有效指標，根據(jù)Huang Lu等[17]的方法，略作修改：1）抗原包被：使用質(zhì)量濃度為20 μg/mL的樣品包被；2）封阻：操作同1.3.6節(jié)（2）；3）一抗反應(yīng)：洗滌樣品孔，每孔加入1∶22稀釋的患者血清100 μL，37 ℃孵育1 h；4）二抗反應(yīng)：洗滌樣品孔，每孔加入100 μL生物素標記的1∶1 000稀釋的羊抗人IgE，37 ℃孵育1 h；5）親和素反應(yīng)：洗滌樣品孔，每孔加入100 μL 1∶20稀釋的HRP標記鏈霉親和素，37 ℃孵育1 h；6）顯色：洗滌樣品孔，每孔加入100 μL OPD底物緩沖液，于37 ℃孵育15 min；7）終止：每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；8）比色：測定490 nm波長處的吸光度。酶解產(chǎn)物的IgE抑制率計算公式同1.3.6節(jié)。

1.3.8 酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)測定

1.3.8.1 酶解產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)測定

取適量脫脂牛乳酶解產(chǎn)物凍干粉與干燥溴化鉀以1∶150比例在瑪瑙研缽中充分研磨并均勻混合，使用壓片機壓片，壓力達到10 T后停止加壓，取出壓片，使用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波數(shù)下掃描32 次。使用Omnic 8.0和Peakfit 4.0軟件對采集的圖譜進行處理。

1.3.8.2 酶解產(chǎn)物游離巰基含量測定

采用Ellman’s DNTB法[18]測定酶解產(chǎn)物游離巰基含量，使用1.0 mL PBS稀釋酶解產(chǎn)物至1 mg/mL，與4.0 mL Tris-Gly緩沖液（含1.042 g Tris、0.676 g Gly、0.117 g EDTA，蒸餾水溶解后定容至100 mL）混合，避光后加入50 μL Ellman’s試劑，以PBS作為空白對照，25 ℃避光反應(yīng)1 h，10 000 r/min離心15 min，測定412 nm波長處吸光度。游離巰基含量按式（3）計算。

式中：n為酶解產(chǎn)物稀釋倍數(shù)；ρ為酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8.3 酶解產(chǎn)物表面疏水性測定

使用ANS熒光探針測定酶解前后產(chǎn)物表面疏水性變化[19]。將待測樣品使用PBS梯度稀釋至0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 0 mg/mL，避光條件下取4.0 mL稀釋后待測樣品與20 μL ANS溶液（10 mL PBS溶解0.025 31 g ANS，避光保存）振蕩混勻，靜置3 min，測定其熒光強度。測定參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，掃描發(fā)射波長400～600 nm，以酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，熒光強度為縱坐標，進行線性回歸分析，擬合曲線斜率即為表面疏水性（H0）。

1.3.8.4 酶解產(chǎn)物粒徑及Zeta電位、脫脂牛乳體系穩(wěn)定性測定

將待測酶解產(chǎn)物置于納米粒度及Zeta電位分析儀中，25 ℃平衡3 min后測定酶解產(chǎn)物粒徑及Zeta電位。使用聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）[20]表示脫脂牛乳體系穩(wěn)定性變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準差，實驗重復3 次，小寫字母不同表示具有顯著差異性。采用GraphPad Prism 8軟件繪圖，使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶一步水解條件的優(yōu)化

2.1.1 雙酶復合添加量和配比對脫脂牛乳酶解效果的影響

由圖1可知，隨著E/S增加，脫脂牛乳的水解度顯著上升（P＜0.05）。5 種不同蛋白酶配比中，堿性蛋白酶與風味蛋白酶配比為1∶3時脫脂牛乳水解度隨E/S增加提高最多，在E/S為6 000 U/g時達到33.89%，風味蛋白酶比例的提高是促使同E/S條件下水解度持續(xù)上升的原因，可能是風味蛋白酶兼具內(nèi)切酶與外切酶的性質(zhì)[21]，可以在更多位點上酶切蛋白質(zhì)，使水解度提高。

圖1 堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量與配比對脫脂牛乳水解度的影響Fig. 1 Effects of E/S ratio and Alcalase/Flavorzyme ratio on degree of hydrolysis of skimmed milk hydrolysates

由圖2可知，在E/S為2 000 U/g時，堿性蛋白酶和風味蛋白酶對CN和α-La酶解效果優(yōu)于β-Lg，隨著E/S提高，β-Lg加快降解，直到E/S為4 000 U/g時，β-Lg條帶完全消失。值得注意的是，在E/S為2 000 U/g條件下，隨著風味蛋白酶的比例升高，β-Lg的降解率下降，此時水解度卻呈現(xiàn)上升趨勢，表明風味蛋白酶對β-Lg降解能力有限。

圖2 堿性蛋白酶與風味蛋白酶添加量與配比對脫脂牛乳水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的影響Fig. 2 Effects of E/S and Alcalase/Flavorzyme ratio on the molecular mass distribution of skimmed milk hydrolysates

過度酶解會產(chǎn)生苦味氨基酸，影響產(chǎn)品的口感[22]。綜合考慮，在保證酶解效果的前提下，確定E/S為3 000 U/g、堿性蛋白酶與風味蛋白酶配比為3∶1為雙酶一步酶解的最適添加量和配比。

2.1.2 雙酶一步酶解時間對脫脂牛乳酶解效果的影響

由圖3可知，在水解60 min內(nèi)，脫脂牛乳水解度呈現(xiàn)顯著上升趨勢（P＜0.05），80 min時水解度超過15%，此時Tricine-SDS-PAGE條帶顯示3 種致敏乳蛋白條帶基本消失，在反應(yīng)后期，由于底物減少，水解度上升趨勢減緩。

圖3 堿性蛋白酶與風味蛋白酶酶解時間對脫脂牛乳水解度（A）及分子質(zhì)量分布（B）的影響Fig. 3 Effects of alcalase and flavorzyme hydrolysis time on degree of hydrolysis (A) and molecular mass distribution (B) of skimmed milk hydrolysates

結(jié)合2.1.1節(jié)結(jié)果，雙酶一步酶解脫脂牛乳的最適條件為E/S=3 000 U/g、堿性蛋白酶與風味蛋白酶配比3∶1、酶解時間80 min。

2.2 雙酶分步酶解對脫脂牛乳酶解效果的影響

蛋白酶添加順序及酶解方式對蛋白質(zhì)水解度及肽類的產(chǎn)生有一定影響[23]，因此確定雙酶一步酶解最適的酶解條件后，從蛋白酶添加順序及酶解時間對分步酶解脫脂牛乳效果進行對比研究。

由圖4可知，組2與組4水解度顯著高于組3及組5（P＜0.05），且組2與組4之間酶解效果差異不顯著。Tricine-SDS-PAGE條帶顯示，組2對β-Lg及α-La降解效果優(yōu)于組4，可能是由于組2中堿性蛋白酶水解時間比組4長，且堿性蛋白酶對β-Lg酶解效果優(yōu)于風味蛋白酶，因此電泳條帶消失更明顯，該結(jié)果與2.1.1節(jié)的結(jié)論互相印證。

圖4 雙酶分步酶解對脫脂牛乳水解度（A）及分子質(zhì)量分布（B）的影響Fig. 4 Effects of two-stept hydrolysis on degree of hydrolysis (A) and molecular mass distribution (B) of skimmed milk hydrolysates

組2～5水解度均顯著低于組1（P＜0.05），電泳條帶結(jié)果表明，雙酶一步酶解對3 種致敏蛋白降解效果均優(yōu)于雙酶分步酶解，因此后續(xù)研究將圍繞雙酶一步酶解展開。

2.3 雙酶一步酶解對脫脂牛乳致敏蛋白IgG結(jié)合能力的影響

2.3.1 酶解對CN與IgG結(jié)合能力的影響

競爭抑制率表示牛乳中殘留的競爭抗原蛋白對兔血清中抗體與標準CN的結(jié)合抑制作用。半抑制質(zhì)量濃度（IC50）表示達到一半抑制率時所需競爭抗原質(zhì)量濃度，IC50與蛋白的抗體結(jié)合能力成反比，即所需競爭抗原質(zhì)量濃度越大，該蛋白的抗體結(jié)合能力越弱，致敏性越低。

由圖5可知，在80 min內(nèi)，CN的IC50隨酶解時間延長而提高，由19.63 μg/mL上升至78.29 μg/mL，CN與IgG結(jié)合能力下降74.93%（P＜0.05），表明水解有效降低了CN的致敏性。

圖5 雙酶一步水解對CN結(jié)合IgG能力的影響Fig. 5 Effects of one-step hydrolysis on IgG binding capacity of casein

2.3.2 酶解對α-La與IgG結(jié)合能力的影響

由圖6可知，堿性蛋白酶與風味蛋白酶復合處理有效降低了α-La的IgG結(jié)合能力，即降低了α-La的致敏性。但是IC50顯示，水解初期，α-La的IgG結(jié)合能力快速下降，在20 min內(nèi)α-La的IC50由3.77 μg/mL上升至220.89 μg/mL，IgG結(jié)合能力顯著下降98.29%（P＜0.05），隨后又上升，在80 min時抑制率為97.24%，致敏性升高但變化不顯著，可能是由于酶解導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，構(gòu)象型表位被破壞，隨著酶解時間延長，更多的抗原表位暴露，暴露速率大于酶解破壞速率，因此導致IgG結(jié)合能力增加。

圖6 雙酶一步酶解對α-La結(jié)合IgG能力的影響Fig. 6 Effects of one-step hydrolysis on IgG binding capacity of α-La

2.3.3 酶解對β-Lg與IgG結(jié)合能力的影響

由圖7可知，在IC50水平上，水解40 min內(nèi)，β-Lg的IgG結(jié)合能力逐漸下降，在40～80 min時間段內(nèi)，IgG結(jié)合能力呈先上升再下降的波動，可能是由于水解時抗原結(jié)合表位不斷暴露所致，80 min時IgG結(jié)合能力最低，IC50從2.62 μg/mL上升到40.06 μg/mL，IgG結(jié)合能力顯著降低93.46%（P＜0.05），致敏性顯著降低。

圖7 雙酶一步酶解對β-Lg結(jié)合IgG能力的影響Fig. 7 Effects of one-step hydrolysis on IgG binding capacity of β-Lg

2.3.4 雙酶一步酶解對脫脂牛乳總蛋白結(jié)合IgG能力的影響

由圖8可知，在酶解60 min內(nèi)，脫脂牛乳總蛋白的IgG結(jié)合能力顯著下降73.8%（P＜0.05），酶解60～80 min，脫脂牛乳IgG結(jié)合能力有所上升但不顯著（P＜0.05），IgG抑制率為69.6%，表明雙酶酶解顯著降低了脫脂牛乳蛋白整體致敏性。酶解60～80 min，脫脂牛乳蛋白IgG結(jié)合能力與α-La的IgG結(jié)合能力變化趨勢相似，可能是由于在此區(qū)間α-La與牛乳中其他成分形成的復合物被破壞，導致致敏性升高。脫脂牛乳作為完整體系成分較為復雜，含有更多種類致敏蛋白及致敏表位，因此IgG結(jié)合能力高于單一致敏蛋白，呈現(xiàn)出更高的致敏性。

圖8 雙酶一步酶解對脫脂牛乳總蛋白IgG結(jié)合能力的影響Fig. 8 Effects of one-step hydrolysis on IgG binding capacity of skimmed milk proteins

2.4 雙酶一步酶解對脫脂牛乳蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 雙酶一步酶解對脫脂牛乳蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

傅里葉變換紅外光譜可以對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基基團、酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶及蛋白質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)化學鍵振動等波段信息進行檢測[24]。酰胺Ⅰ帶區(qū)域（1 600～1 700 cm-1）是C＝O鍵振動主要區(qū)域，該區(qū)域譜峰與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)存在對應(yīng)關(guān)系[25]。由圖9可知，脫脂牛乳蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊為主，其相對含量均為32%，并有少量β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，相對含量分別為19%及17%。隨著酶解時間的延長，脫脂牛乳蛋白中α-螺旋相對含量顯著降低，可能是由于酶解使蛋白質(zhì)螺旋結(jié)構(gòu)展開或斷裂，β-折疊結(jié)構(gòu)的減少表明蛋白質(zhì)彈性結(jié)構(gòu)被破壞；β-轉(zhuǎn)角相對含量呈現(xiàn)增加的趨勢，可能在酶解過程中α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)換，蛋白的抗原結(jié)合位點大多存在于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[26]，此過程也可能導致β-轉(zhuǎn)角抗原結(jié)合位點暴露，使脫脂牛乳致敏性增加，與2.3.4節(jié)結(jié)果一致；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對含量下降表明酶解使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變。

圖9 雙酶一步酶解對脫脂牛乳蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig. 9 Effects of one-step hydrolysis on secondary structure of skimmed milk proteins

2.4.2 雙酶一步酶解對脫脂牛乳游離巰基含量的影響

巰基通過交聯(lián)形成的二硫鍵維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，其含量的變化也表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[27]。由圖10可知，在0～20 min內(nèi)脫脂牛乳中游離巰基含量極顯著增加（P＜0.01），隨后20～80 min含量達到14.29 μmol/g，增加顯著（P＜0.05），表明酶解破壞了脫脂牛乳蛋白空間結(jié)構(gòu)，使二硫鍵斷裂。有研究表明，β-Lg內(nèi)部包含的游離巰基Cys 121位點所在肽段AA 102～124可被超過97%牛乳過敏患者血清識別[28]，酶解過程中脫脂牛乳蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊化會導致游離巰基Cys 121位點暴露，使脫脂牛乳致敏性增加。

圖10 雙酶一步酶解對脫脂牛乳游離巰基含量的影響Fig. 10 Effects of one-step hydrolysis on free sulfhydryl content of skimmed milk

2.4.3 雙酶一步酶解對脫脂牛乳H0的影響

蛋白質(zhì)疏水性基團之間可以通過相互作用力維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，通過蛋白質(zhì)表面疏水性變化可以了解蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變，熒光光譜的最大熒光強度與蛋白質(zhì)表面疏水性呈線性關(guān)系[29]。由圖11可知，酶解后的脫脂牛乳蛋白熒光強度上升，熒光光譜發(fā)生藍移，在40 min內(nèi)脫脂牛乳蛋白H0顯著上升（P＜0.05），與2.4.1節(jié)結(jié)果結(jié)合分析，可能是由于脫脂牛乳蛋白被酶解破壞，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性結(jié)構(gòu)暴露。40～80 min，脫脂牛乳蛋白H0每20 min間隔內(nèi)上升不顯著，可能是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，疏水性基團互相交聯(lián)，重新掩埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，阻礙與ANS熒光探針的結(jié)合，使H0增加不顯著。

圖11 雙酶一步酶解對脫脂牛乳蛋白H0的影響Fig. 11 Effects of one-stephydrolysis on H0 of skimmed milk

2.4.4 雙酶一步酶解對脫脂牛乳Zeta電位的影響

由圖12可知，酶解80 min內(nèi)脫脂牛乳呈負Zeta電位，未酶解時脫脂牛乳具有較強負電位（-（12.15±0.21） mV），表明此時體系中帶有同種電荷的粒子較多，粒子間斥力較大，體系穩(wěn)定。酶解開始后Zeta電位絕對值顯著下降（P＜0.05），酶解40 min以后Zeta電位變化不顯著，表明酶解使脫脂牛乳體系中帶電粒子表面凈電荷減少，粒子間靜電斥力減弱，更易發(fā)生聚集，使脫脂牛乳體系穩(wěn)定性降低[30]。

圖12 雙酶一步酶解對脫脂牛乳Zeta電位的影響Fig. 12 Effects of one-step hydrolysis on Zeta potential of skimmed milk

2.4.5 雙酶一步酶解對脫脂牛乳粒徑的影響

由圖13可知，脫脂牛乳平均粒徑隨酶解時間延長顯著增加（P＜0.05），平均粒徑由248 nm顯著上升至470 nm（P＜0.05），80 min后平均粒徑為346.9 nm，與Zeta電位結(jié)果一致，可能由于粒子間發(fā)生了聚集。粒度分布結(jié)果顯示，脫脂牛乳的粒度呈正態(tài)分布，峰值約為295 nm，酶解20 min分布后形成分別位于220 nm及1 281 nm附近的雙峰，可能由于酶解破壞大分子蛋白質(zhì)使粒徑減小，與此同時也改變了脫脂牛乳體系凈電荷數(shù)目，使粒子產(chǎn)生聚集，導致粒徑增加。脫脂牛乳的PDI顯著上升（P＜0.05），表明酶解處理導致脫脂牛乳體系穩(wěn)定性變差[31]。

圖13 雙酶一步酶解對脫脂牛乳粒度分布（A）、平均粒徑及PDI（B）的影響Fig. 13 Effects of one-step hydrolysis on the particle size distribution (A),average particle size and PDI (B) of skimmed milk

2.5 雙酶水解脫脂牛乳蛋白對過敏患者血清IgE結(jié)合能力的影響

由圖14可知，雙酶一步酶解脫脂牛乳蛋白80 min后，IgE結(jié)合能力顯著降低23.53%（P＜0.05），大多數(shù)的牛乳過敏反應(yīng)是由IgE介導的Ⅰ型超敏反應(yīng)，因此脫脂牛乳IgE結(jié)合能力的降低表明雙酶混合酶解可以有效降低脫脂牛乳致敏性。

圖14 雙酶水解脫脂牛乳蛋白對過敏患者血清IgE結(jié)合能力的影響Fig. 14 Effects of one-step hydrolysis on binding capacity of skimmed milk proteins to serum IgE from patients with milk allergy

3 結(jié) 論

本研究以酶解產(chǎn)物水解度、分子質(zhì)量分布、與IgG及患者血清IgE結(jié)合能力為考察指標，研究雙酶復合處理中酶添加量、酶配比、酶解方式對脫脂牛乳水解效果的影響，確定雙酶一步水解E/S為3 000 U/g、堿性蛋白酶與風味蛋白酶配比為3∶1、水解80 min的條件下脫脂牛乳中主要致敏乳蛋白CN、α-La、β-Lg的IgG結(jié)合能力分別下降74.93%、97.24%、93.46%（P＜0.05），酶解破壞脫脂牛乳蛋白高級結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，β-折疊結(jié)構(gòu)減少，游離巰基含量顯著增加至14.29 μmol/g（P＜0.05），表面疏水性增強，結(jié)構(gòu)趨于松散；脫脂牛乳體系中粒子發(fā)生聚集，平均粒徑顯著增加至346.9 nm（P＜0.05），穩(wěn)定性降低；酶解產(chǎn)物對牛乳過敏患者血清IgE結(jié)合能力顯著降低（P＜0.05），降低率達23.53%，脫脂牛乳蛋白整體致敏性顯著降低69.6%（P＜0.05）。與其他降低脫脂牛乳蛋白致敏性方法相比，雙酶法具有作用條件溫和、對致敏蛋白降解率高等優(yōu)勢，本研究為開發(fā)低致敏牛乳制品提供了參考。