魏家祺，周勝云，叢艷君,*，閆文杰

（1.北京工商大學食品與健康學院，北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；2.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023）

據(jù)統(tǒng)計，全世界每天消耗的牛乳總量約為810 億t[1]。鮮牛乳通常經(jīng)過多種加工方式形成產(chǎn)品，以確保人類食用安全，熱加工是常用的處理方式之一[2]，目前，乳品工業(yè)中常用的液態(tài)乳熱加工方法主要有：預熱殺菌法、巴氏殺菌法、超高溫滅菌法和保持殺菌法，加熱溫度和加熱時間是決定乳品品質(zhì)的關鍵因素。

牛乳中含量最高的蛋白質(zhì)是酪蛋白，其由4 種組分構成，αs1-酪蛋白是含量最高的組分，也是主要過敏原[3]。研究表明，酪蛋白對熱處理非常穩(wěn)定，加熱使其致敏性僅部分降低或沒有變化[4]。Bloom等[5]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白在95 ℃溫度下加熱60 min后，基本上不會影響其免疫反應性。Morisawa等[6]研究表明，經(jīng)過熱處理的α-酪蛋白不會影響嗜堿性粒細胞釋放的組胺量。但是有研究[7]表明，加熱到65～70 ℃時，α-酪蛋白的致敏性降低，而β-酪蛋白的致敏性顯著增加，從而得出結論，不同加熱條件下，過敏原蛋白質(zhì)表現(xiàn)出不同的敏感性。

本研究通過8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針光譜、圓二色譜、間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡實驗方法探究不同加熱條件下αs1-酪蛋白構象與抗原性的關系，揭示熱加工方式調(diào)控αs1-酪蛋白抗原性的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳 三元食品公司。

低分子質(zhì)量標準蛋白 天根生化科技（北京）有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠免疫球蛋白G 北京友誼中聯(lián)公司；抗血清（多克隆抗體） 實驗室自制；Tris（優(yōu)級純）、甘氨酸（優(yōu)級純）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，優(yōu)級純）、考馬斯亮藍（分析純）、甲醇（分析純）、醋酸（優(yōu)級純）、吐溫-20（優(yōu)級純）、乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；αs1-酪蛋白（純度70%）、丙烯酰胺（優(yōu)級純）、甲叉雙丙烯酰胺（優(yōu)級純）、過硫酸銨（優(yōu)級純）、四甲基乙二胺（優(yōu)級純）、α-巰基乙醇（優(yōu)級純）、甘油（優(yōu)級純）、牛血清白蛋白V bovine serum albumin V，BSA，生物級）、四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB，優(yōu)級純）、二甲基亞砜（優(yōu)級純）、氨基黑（優(yōu)級純）、4-氯-1-萘酚（優(yōu)級純） 美國Sigma公司；濃鹽酸（分析純） 北京化學試劑公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、碳酸氫鈉（均為分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

KHB ST-360酶標儀 上海科華實驗系統(tǒng)有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設備有限公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SH-2磁力攪拌器 北京東方開物科學器材有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；DYY-7C電泳儀 北京市六一儀器廠；CR22G離心機 日本Hitachi公司；F-7000圓二色譜儀 日本日立公司；RF5301熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳酪蛋白制備

鮮牛乳通過3 層消毒紗布過濾，除去雜質(zhì)，然后用高速冷凍離心機（8 000 r/min、4 ℃、10 min）脫脂，得到脫脂乳。脫脂乳于40 ℃水浴鍋內(nèi)保溫，5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6，沉淀30 min后用高速冷凍離心機離心分離（8 000 r/min、4℃、15 min），收集沉淀，得到酪蛋白[8-9]。

將分離的酪蛋白和αs1-酪蛋白標準品分別溶于50 mmol/mL、pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，配制成0.1 mg/mL的溶液，于70、80、90、100 ℃分別加熱10、20、30、40、50、60 min，于-20 ℃冰浴冷卻。

1.3.2 圓二色譜分析加熱αs1-酪蛋白二級結構變化

使用圓二色譜儀在遠紫外區(qū)（190～260 nm），于室溫25 ℃條件下測定0.1 mg/mL熱處理的αs1-酪蛋白標準溶液，測定6 次取平均值。圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減，利用楊氏算法得出αs1-酪蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲含量。

1.3.3 ANS熒光探針分析加熱αs1-酪蛋白的疏水性變化

不同熱處理的0.1 mg/mLαs1-酪蛋白標準溶液3 mL，加入15 μL ANS溶液作為熒光探針并于室溫放置1 h。樣品用熒光分光光度計掃描，掃描條件為激發(fā)波長390 nm，掃描波長400～650 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速率100 nm/min，以特征熒光強度表示疏水性。

1.3.4αs1-酪蛋白多克隆抗體制備

用αs1-酪蛋白免疫C3H/He小鼠制備αs1-酪蛋白多克隆抗體。參考Peng Juan[10]、Yeung[11]等的方法，取6 只體質(zhì)量為20～25 g的C3H/He小鼠，將0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分混合并乳化后，在小鼠背部皮下分6 點免疫；第22天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白和等體積弗氏不完全佐劑乳化至混合物在水中不擴散，小鼠腹腔免疫；第36天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白溶液小鼠腹腔免疫；第50天，取0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白溶液小鼠腹腔免疫；第60天，取6 只小鼠全血，離心制備血清備用。1 只未免疫的小鼠血清為陰性血清，作為對照。

1.3.5 間接競爭ELISA方法的建立和牛乳中αs1-酪蛋白殘留量的測定

在優(yōu)化酶標二抗稀釋倍數(shù)、抗原稀釋倍數(shù)、抗血清稀釋倍數(shù)、包被抗原和抗血清反應溫度和時間、底物最佳反應條件基礎上，按照間接競爭ELISA程序，競爭抗原質(zhì)量濃度0～1 400 ng/mL范圍內(nèi)建立間接競爭ELISA抑制曲線，并用此方法測定牛乳中αs1-酪蛋白的殘留量。

間接競爭ELISA的具體步驟：以αs1-酪蛋白作為包被抗原，用0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將αs1-酪蛋白稀釋至5 μg/mL后，以100 μL/孔加入酶標板中，于4 ℃冰箱中過夜。αs1-酪蛋白抗原與一抗初級反應：在反應管中加入1∶1的αs1-酪蛋白抗原或待測樣品（鮮牛乳）和1∶4 000稀釋后的鼠多抗，不加αs1-酪蛋白抗原或樣品的反應管作為無競爭反應體系，4 ℃冰箱中反應12 h。之后傾去酶標板孔內(nèi)的液體，用200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干。加入添加1 g/100 mL BSA的PBST封閉液進行封閉，每孔100 μL，37 ℃放置1 h，200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干。將αs1-酪蛋白抗原與一抗混合物以100 μL/孔的量加入酶標板內(nèi)，于37 ℃溫育2 h。用PBST洗板4 次，200 μL/孔，每次5 min，甩干。用含1 g/100 mL BSA的PBST將HRP-羊抗鼠IgG稀釋5 000 倍，以100 μL/孔加入孔內(nèi)，37 ℃反應1 h。用200 μL/孔的PBST洗板3 次，200 μL/孔的雙蒸水洗板2 次，每次5 min，甩干。加入新鮮配制的TMB應用液，100 μL/孔，常溫暗處反應25 min，顯示藍色。每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，顏色由藍變黃，用酶標儀測定波長450 nm處的光密度（OD450nm）[12-15]。

式中：B為梯度稀釋αs1-酪蛋白作為競爭抗原測定的OD450nm；B0為無競爭體系的OD450nm；B1為未免疫小鼠血清作為一抗測定的OD450nm。

1.3.6αs1-酪蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

以分離的酪蛋白為研究對象。分離膠12.5%、濃縮膠4.5%、膠聯(lián)度3.6%，進行垂直電泳，單板恒流10 mA。具體實驗步驟為：αs1-酪蛋白抗原或樣品溶液與電泳樣品稀釋液以體積比3∶1比例混合，于沸水浴處理5 min后上樣，上樣量10 μL。電泳結束后的分離膠用考馬斯亮藍R-250染色15 min，顯現(xiàn)蛋白條帶，以低分子質(zhì)量標準蛋白做標準，用凝膠成像系統(tǒng)分析其分子質(zhì)量。

1.3.7αs1-酪蛋白免疫印跡鑒定

將分離的酪蛋白首先進行SDS-PAGE，然后將膠上的蛋白轉印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，將膜用加樣梳、鉛筆作標記，將PVDF膜剪裁，與SDS-PAGE凝膠中分離膠大小一樣，再將PVDF膜、濾紙和海綿一同浸泡于電極緩沖液（含20%甲醇的Tris-甘氨酸緩沖溶液）中30～60 min。將電泳完畢的SDS-PAGE分離膠取下，放入電轉緩沖液中平衡20～30 min，在干凈、平整的實驗臺上按以下順序從正極到負極鋪于凝膠夾上：凝膠夾板→海綿→3 層濾紙→PVDF膜→凝膠→3 層濾紙→海綿→凝膠夾板（此過程中應避免氣泡產(chǎn)生，用光滑的玻璃棒從一側向另一側慢慢滾動，趕出氣泡），夾緊“凝膠三明治”插入轉移電泳槽，灌滿緩沖液。將PVDF膜端靠近正極，凝膠面靠近負極，打開電源，定流192 mA，電轉移4.0 h。轉印后的PVDF膜一式2 份，1 份用氨基黑10B溶液染色5 min，脫色5 min，觀察轉印效果及蛋白質(zhì)位置，另1 份用于免疫印跡。

將轉印后的PVDF膜于大小合適的平皿中用dH2O洗滌5 min，用TBST溶液（添加體積分數(shù)0.05%吐溫-20的pH 7.4 Tris緩沖溶液）于37 ℃漂洗4 次，每次15 min。再加入裝有封閉液（10～20 mL）的平皿中，于37 ℃孵育1 h，封閉PVDF膜，然后用dH2O洗滌5 min。將PVDF膜與1∶4 000 倍稀釋的多抗于37 ℃孵育2 h，再用dH2O洗滌5 min，用TBST洗滌3 次，每次10 min。將PVDF膜與合適濃度的HRP標記羊抗鼠二抗（1∶5 000稀釋）于37 ℃孵育1 h，再用dH2O洗滌5 min，TBST溶液洗滌3 次，每次10 min。將漂洗后的PVDF膜浸沒在新鮮配制的0.05 mol/L 4-氯-1-萘酚底物溶液中，顯色（37 ℃，35～40 min），待蛋白條帶顯色清晰，即可用高純水漂洗，終止反應。用dH2O沖凈PVDF膜，置于雙層濾紙中風干保存[7,16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均做3 個平行，3 次重復。用Origin 8軟件繪制圖表，SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s multiple range test方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 圓二色譜分析αs1-酪蛋白的二級結構變化

采用圓二色譜分析蛋白質(zhì)時，192 nm波長附近α-螺旋結構有1 個正譜帶，波長208、222 nm附近有2 個負譜帶，波長185～200 nm附近β-折疊有1 個正譜帶，波長216 nm附近有1 個負譜帶，波長206 nm附近β-轉角有1 個正譜帶[17-18]。

由圖1可知：圓二色譜顯示，在208～212 nm和218～222 nm附近有峰存在，這是α-螺旋結構的典型特征，說明有α-螺旋存在；波長224～230 nm附近有微弱且較寬的譜帶，說明有β-折疊或者富含L-脯氨酸序列的區(qū)域[19]。

圖1 加熱處理的αs1-酪蛋白圓二色譜圖Fig. 1 CD spectra of heated αs1-casein

由表1可知，αs1-酪蛋白經(jīng)熱處理后其二級結構構象發(fā)生變化，α-螺旋、β-折疊含量降低，在80 ℃、60 min，90 ℃、10 min，90 ℃、60 min條件下，α-螺旋含量顯著低于未加熱αs1-酪蛋白。70 ℃、20 min，80 ℃、20 min，90 ℃、20 min時無規(guī)卷曲含量顯著增加。而韓波[20]通過圓二色譜分析技術研究牛乳酪蛋白分別于63 ℃、30 min，75℃、20 s，100 ℃、5 min，134 ℃、4 min加熱條件下二級結構構象的變化情況，發(fā)現(xiàn)不同的加熱條件并沒有使牛乳酪蛋白的二級結構構象發(fā)生顯著變化。故加熱對αs1-酪蛋白構象的影響有待深入研究。

表1 αs1-酪蛋白的二級結構含量Table 1 Secondary structure composition of unheated and heated αs1-casein %

2.2 ANS熒光探針光譜分析αs1-酪蛋白表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)分子之間的疏水作用是維持其構象的主要作用力，同時對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)也存在一定的影響[21]，本研究采用ANS熒光探針法研究經(jīng)不同熱處理的αs1-酪蛋白表面疏水性的變化情況[22]。由圖1可知：αs1-酪蛋白的疏水性結構隨著不同的處理時間和溫度發(fā)生變化。在70～100 ℃加熱處理下，αs1-酪蛋白表面疏水性均隨時間的延長呈無規(guī)則變化趨勢，70～80 ℃時，加熱20 min時相對最強，50 min時相對最低，60 min又趨于增強；90 ℃時，加熱20 min時相對最強，加熱60 min相對最低，100 ℃時，加熱20 min相對最強，加熱10 min相對最低，加熱40、50、60 min又趨于增強。另外αs1-酪蛋白的濃度也會影響其展開和聚合程度。隨著加熱溫度的升高，體系中αs1-酪蛋白重新組成聚合體，也會導致其疏水性下降[23]。

圖2 加熱處理的αs1-酪蛋白的表面熒光強度Fig. 2 Surface fluorescence intensity of heated αs1-casein

2.3 間接競爭ELISA測定牛乳中αs1-酪蛋白殘留量結果

由圖3可知，牛乳中αs1-酪蛋白的殘留量在加熱溫度為70 ℃和90 ℃時，隨時間的延長變化趨勢相近，具體為0～20 min隨時間的延長上升，20～30 min趨于下降，30～40 min趨于上升，之后趨于下降。于80 ℃和100 ℃加熱，隨時間的延長變化趨勢相近，具體為0～20 min隨時間的延長上升，20～30 min趨于下降，30～40 min又趨于上升，40～50 min趨于下降，60 min以后又處于上升階段。

圖3 熱處理牛乳中αs1-酪蛋白殘留量Fig. 3 Residual amount of αs1-casein in heated milk

采用Duncan’s multiple range test方法分析，鮮牛乳在70 ℃分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），αs1-酪蛋白殘留量最高的是20 min處理組，為（4 551.26±0.26） ng/mL，最低的是60 min處理組，為（4 497.02±1.16） ng/mL；鮮牛乳在80 ℃分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），最高的是20 min處理組，為（4 593.99±0.64） ng/mL，最低的是0 min組（對照組），為（4 513.46±1.16） ng/mL；鮮牛乳在90 ℃分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），最高的是20 min處理組，為（4 615.36±1.04） ng/mL，最低的是對照組，為（4 513.46±1.16） ng/mL；鮮牛乳在100 ℃分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），最高的是20 min處理組，為（4 575.92±1.39） ng/mL，最低的是對照組，為（4 513.46±1.16） ng/mL。綜上分析，70、80、90、100 ℃加熱處理牛乳時均為在20 min時表現(xiàn)出較強的抗原性，分析其原因可能是加熱使牛乳中αs1-酪蛋白構象發(fā)生變化，更多的作用表位暴露出來，從而導致致敏性增強。70 ℃加熱處理60 min時αs1-酪蛋白殘留量為4 497.02 ng/mL，較對照組的過敏原殘留量低，表現(xiàn)出較低抗原性。

2.4 αs1-酪蛋白SDS-PAGE分析結果

由圖4可知，不同加熱處理對αs1-酪蛋白的分子質(zhì)量沒有影響，通過凝膠成像技術測得αs1-酪蛋白分子質(zhì)量約為32 kDa。

圖4 不同加熱處理αs1-酪蛋白SDS-PAGE分析圖Fig. 4 SDS-PAGE patterns of heated αs1-casein

2.5 αs1-酪蛋白免疫印跡鑒定結果

SDS-PAGE之后將不同熱處理的酪蛋白轉印到PVDF膜上，通過免疫印跡實驗進行鑒定。由圖5可知，未免疫小鼠血清作為陰性對照與酪蛋白沒有產(chǎn)生反應條帶，說明小鼠多克隆抗體與經(jīng)不同熱處理的αs1-酪蛋白發(fā)生了特異性免疫反應。這個結果既驗證了多克隆抗體的特異性，又說明熱處理后αs1-酪蛋白的致敏性依然存在。

圖5 αs1-酪蛋白免疫印跡鑒定圖Fig. 5 Western blotting of αs1-casein

食品熱加工可以誘導過敏原蛋白質(zhì)結構發(fā)生不同改變，如聚集、去折疊等，這些改變都可能影響IgE結合能力，從而增加或降低過敏原的致敏性[24]。通常歸因于食物基質(zhì)中過敏原蛋白質(zhì)構象表位的破壞或其與脂肪或糖發(fā)生的化學反應限制了過敏原對免疫系統(tǒng)的可用性；另一方面，食物基質(zhì)的作用使過敏原蛋白質(zhì)新表位形成及消化率降低可能會增加其致敏性[25]。研究牛乳熱加工技術對于過敏原致敏性的影響，對于優(yōu)化乳品熱加工工藝、開發(fā)低致敏乳制品均具有重要意義。

3 結 論

本研究表明：在80 ℃、60 min，90 ℃、10 min，90 ℃、60 min條件下熱處理后，αs1-酪蛋白中α-螺旋結構含量顯著低于未加熱αs1-酪蛋白，在70 ℃、20 min，80 ℃、20 min，90 ℃、20 min條件下熱處理后，αs1-酪蛋白中無規(guī)卷曲含量顯著增加，70～100 ℃加熱20 min條件下表面熒光強度最強，間接競爭ELISA顯示，在70～100 ℃、20 min條件下，αs1-酪蛋白的抗原殘留量均較高，而免疫印跡方法顯示，不同溫度-時間加熱條件下αs1-酪蛋白仍具有免疫反應特性，建議進一步通過動物實驗揭示熱處理調(diào)控αs1-酪蛋白抗原性的機制。