譚宏凱，程劍鋒，熊子奕，胡 巍，李 欣,3,*，陳紅兵

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學 江西省食物過敏重點實驗室，江西 南昌 330047；4.南昌大學 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

牛乳及乳制品因其高營養(yǎng)價值而深受消費者喜愛，然而，牛乳過敏嚴重影響過敏人群的食用安全。牛乳及乳制品被世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織確定為8 種主要過敏食物類別之一[1]。牛乳過敏的臨床癥狀包括濕疹、呼吸困難、腹痛、嘔吐等[2]，嚴重者甚至會導致患者休克和死亡。牛乳過敏是生命早期的常見疾病，患病率為2%～7%，且呈上升趨勢[3]。在最近對6 768 名1 歲以下中國嬰兒的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)牛乳過敏的患病率為2.69%[4]。酪蛋白約占牛乳蛋白的80%，是牛乳中含量最豐富且最容易引起牛乳過敏的蛋白質(zhì)[5-6]。酪蛋白具有很高的營養(yǎng)價值和特殊的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，已廣泛應用于功能性食品工業(yè)[7-9]。研究如何降低酪蛋白致敏性至關重要。已經(jīng)有許多加工技術可用于降低牛乳蛋白的致敏性，包括熱處理、糖基化和酶解[10-12]。其中，酶解是一種溫和、安全、有效的降低乳蛋白致敏性的加工技術，已被廣泛用于生產(chǎn)低致敏性蛋白水解物[13-16]。

酶解能夠破壞乳蛋白的非線性表位與線性表位，抗原表位是否保留很大程度上取決于乳蛋白水解度及酶解使用的酶種類[17]。當?shù)鞍酌杆舛群线m時，可以破壞乳清蛋白的抗原線性表位，降低其致敏性[18-19]。通過篩選蛋白酶，切斷酪蛋白的表位，能夠從根本上解決蛋白質(zhì)致敏問題，對保障牛乳過敏人群的安全消費具有重要意義。此外，酶解可以產(chǎn)生多種新肽，保持乳蛋白的營養(yǎng)價值，并為嬰幼兒提供許多生理益處[20-21]。

本研究以酪蛋白為酶解底物，選取7 種食品級蛋白酶酶解酪蛋白，降低其致敏性。以蛋白酶酶解后酪蛋白殘留致敏原性、水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布、水解度為主要指標，篩選出消減酪蛋白致敏原性效果最佳的蛋白酶，為制備低致敏酪蛋白產(chǎn)品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白、菠蘿蛋白酶（600 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、生物素標記羊抗人IgE、抗酪蛋白抗體 美國Sigma公司；胰凝乳蛋白酶（45 U/mg） 北京邁瑞達科技有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（50 U/mg）、復合風味蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（300 U/mg） 丹麥諾維信公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Vortex Genius 3漩渦混合器 德國IKA公司；LK-120A電子天平 日本A&D公司；超純水系統(tǒng)德國Milipore公司；Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀、Sorvall ST 16R高速冷凍離心機 立陶宛Thermo公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司；SRT-202滾軸式混合器 江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解

選取市面上7 種食品級蛋白酶，以一定的條件酶解酪蛋白。取酪蛋白固體粉末溶解于超純水中配制成24 mg/mL的酪蛋白溶液，吸取20 mL于50 mL離心管中，在設定溫度下預熱后，加入設定比例的不同蛋白酶進行水解，水解過程中不斷攪拌，水解完成后99 ℃水浴處理15 min滅酶，冷卻后300×g離心5 min取上清，分裝保存。酶解條件如表1所示。

表1 酪蛋白酶解條件[22-25]Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of casein[22-25]

1.3.2 酪蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量變化

采用三(羥甲基)甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）分析酪蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量變化。參考熊鼎[25]的配方，依次制備16.5%分離膠、10%夾層膠和4%濃縮膠。設定電泳程序，恒壓30 V運行1 h，100 V電壓運行3 h，當溴酚藍指示劑接近凝膠底部時停止電泳。以低分子質(zhì)量Marker標準為參比，得到所需蛋白條帶。樣品上樣量均為15 μL。用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行掃描成像。

1.3.3 Western blotting分析

采用免疫印跡法（Western blotting）測定血清IgG與酪蛋白組分的結(jié)合特點[26]。按照1.3.2節(jié)步驟，將酪蛋白及酶解樣品進行Tricine-SDS-PAGE，電泳結(jié)束后取出凝膠，用蒸餾水漂洗3 次，每次5 min，然后置于轉(zhuǎn)運緩沖液中浸泡。準備硝酸纖維素（nitrocellulose membrane，NC）膜與濾紙，以凝膠大小裁剪，浸泡于轉(zhuǎn)運緩沖液中。按照“濾紙-凝膠-NC膜-濾紙”的順序組裝，組裝過程排除氣泡。將裝好的轉(zhuǎn)膜裝置放入蛋白轉(zhuǎn)印儀中，加入轉(zhuǎn)運緩沖液，以100 V、2 h的程序開始電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后將膜取出用洗脫液漂洗3 次，每次5 min，用封阻液于37 ℃搖床中封阻1 h。封阻結(jié)束，再次漂洗，加入一抗兔血清（使用含體積分數(shù)0.1%吐溫-20的Tris緩沖液，以1∶5 000稀釋），置于4 ℃孵育過夜，次日取出漂洗。加入HRP標記的羊抗兔IgG（使用含體積分數(shù)0.1%吐溫-20的Tris緩沖液，以1∶5 000稀釋），于37 ℃搖床中孵育1 h，用洗脫液漂洗，最后用顯色液顯色、成像。

1.3.4 酪蛋白酶解產(chǎn)物水解度測定

水解度能夠評價水解過程中蛋白降解程度[27]。水解度測定采用OPA法，具體操作如下：準確吸取400 μL樣品加入到含有3 mL OPA溶液的離心管中，混勻后避光反應2 min，用紫外分光光度計在340 nm波長處測定不同樣品吸光度。配制不同濃度的精氨酸稀釋液，以精氨酸濃度（mmol/g）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)合標準曲線，按式（1）計算水解度。

式中：n為樣品的稀釋倍數(shù)；ht為待測樣品吸光度在標準曲線上對應的濃度（mmol/g）；hc為未水解蛋白吸光度在標準曲線上對應的濃度（mmol/g）；htot為常量，指每克原蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量，酪蛋白htot=8.20 mmol/g。

1.3.5 反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法檢測酪蛋白酶解產(chǎn)物中肽段

參考Picariello等[28]的實驗方法，利用RP-HPLC法分析酪蛋白酶解產(chǎn)物中的肽段。流動相A：2 mL三氟乙酸加入1 998 mL超純水中，混勻，真空泵抽濾，過0.22 μm孔徑的水系濾膜；流動相B：2 mL三氟乙酸加入1 998 mL乙腈中，混勻，真空泵抽濾，過0.22 μm孔徑的有機濾膜。以上2 種溶液均需超聲30 min以上以充分除氣。酶解后樣品稀釋至2 mg/mL后用0.22 μm水系濾膜過濾。色譜柱為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫45 ℃，70 min內(nèi)使用流動相B體積分數(shù)從5%增加至60%對肽段進行分離，紫外檢測波長為214 nm。

1.3.6 酪蛋白酶解產(chǎn)物IgG結(jié)合能力測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）對酶解后酪蛋白的IgG結(jié)合能力進行評估[25]。1）包被抗原：在96 孔酶標板中包被0.5 μg/mL酪蛋白，100 μL/孔，4 ℃過夜；2）封阻：次日傾去包被液，用含體積分數(shù)0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，5 min/次；每孔加入250 μL 3 g/100 mL明膠溶液進行封阻，37 ℃孵育1 h；3）板外競爭：另取一塊新的酶標板以同樣的方式進行封阻，按相同條件洗板之后，每孔加入60 μL酪蛋白酶解液上清（競爭抗原）和等體積的兔抗酪蛋白血清（1∶8 000稀釋），37 ℃孵育1 h后，每孔吸取100 μL轉(zhuǎn)移至第1塊板內(nèi)進行競爭反應，繼續(xù)37 ℃孵育1 h后洗板；4）二抗反應：每孔加入100 μL HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），37 ℃反應1 h；5）顯色：洗板后，每孔加入100 μL現(xiàn)配的3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液，37 ℃避光反應15 min；6）終止反應：顯色反應結(jié)束后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液終止反應。

用酶標儀在450 nm波長處測定光密度（OD450nm）。根據(jù)OD450nm繪制不同酶解樣品的競爭抑制性曲線，計算出IC50，用于表征IgG結(jié)合能力的變化。抑制率按式（2）計算。

式中：B0為無競爭抗原時的OD450nm；B為有競爭抗原時對應的OD450nm。

1.3.7 酪蛋白酶解產(chǎn)物IgE結(jié)合能力測定

采用ic-ELISA檢測IgE結(jié)合能力[25]?；静僮鞑襟E同1.3.6節(jié)，其中包被抗原時，酪蛋白包被質(zhì)量濃度變?yōu)? μg/mL；板外競爭時，以牛乳過敏患者血清（1∶100稀釋）作為一抗；二抗反應時，二抗使用生物素標記的羊抗人IgE（1∶5 000稀釋），37 ℃反應1 h后，再加入100 μL/孔HRP標記的親和素（1∶60稀釋），37 ℃反應1 h；其余步驟不變。最后計算出IC50，用于表征IgE結(jié)合能力的變化。所用牛乳過敏患者的血清池是由10 位牛乳過敏患者的血清等體積混合制備而成，這10 位患者的血清符合對牛乳過敏呈陽性條件，即特異性IgE水平大于1.0 IU/mL。

1.3.8 酪蛋白T細胞表位預測

從NCBI檢索到牛乳4 種酪蛋白氨基酸序列，然后通過NetMHC（Ⅱ）/pan（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/）、SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/）和IEDB（http://www.iedb.org/）預測4 種酪蛋白的T細胞表位，并對酪蛋白的T細胞表位信息進行匯總。

1.3.9 胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物中殘留T細胞表位肽鑒定

對胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術來鑒定肽段信息，以分析表位肽殘留情況。樣品采用液相系統(tǒng)進行分離。流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B為體積分數(shù)84%乙腈水溶液（含體積分數(shù)0.1%甲酸）。色譜柱以95%流動相A平衡后，樣品由自動進樣器上樣至Trap柱。多肽和多肽碎片的質(zhì)荷比按照以下方法采集：每次全掃描（Full scan）后采集20 個碎片圖譜（MS2scan）。質(zhì)譜測試原始文件（Raw file）用Maxquant 1.5.5.1軟件檢索相應的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，每組實驗重復3 次，使用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量變化

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)肽鏈，破壞致敏蛋白的結(jié)構(gòu)，將其水解為小分子蛋白、多肽甚至是氨基酸，從而顯著降低蛋白質(zhì)的致敏性[29]。由圖1A可知，1號泳道為未酶解的酪蛋白，分子質(zhì)量主要集中在20～30 kDa，3號和6號泳道分別為木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解酪蛋白產(chǎn)生的酶解肽，在5～10 kDa處有大量肽段殘留，其他組別未見明顯肽段殘留。Wroblewska等[30]發(fā)現(xiàn)，酶解酪蛋白的抗原性主要存在于分子質(zhì)量大于10 kDa的肽段，隨著分子質(zhì)量的減小，抗原性逐漸降低。Nakamura等[31]研究表明，分子質(zhì)量1 600～3 500 Da的酪蛋白水解肽段不能引起IgE介導的過敏反應。因此從酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量而言，復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解酪蛋白較為徹底，無3.5 kDa以上分子質(zhì)量的肽段殘留，致敏風險較小。而木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物則含有大量5～15 kDa肽段殘留，存在較高的致敏風險。

由圖1B可知，2、4、5、7、8泳道分別對應復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶處理，無條帶出現(xiàn)，表明酪蛋白組分與血清IgG未發(fā)生結(jié)合，無致敏肽段殘留。Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量為5～15 kDa，Western blotting結(jié)果顯示其僅在10～15 kDa顯示條帶，而5～10 kDa未顯示條帶，表明木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量5～10 kDa時致敏性基本被消除，這與Wroblewska等[30]的研究結(jié)果相一致。泳道6對應的菠蘿蛋白酶在5～15 kDa有大量致敏肽段殘留，且分子質(zhì)量分布范圍較寬，其酶解降低致敏性效果最差。

圖1 酪蛋白酶解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE圖（A）和Western blotting結(jié)果（B）Fig. 1 Tricine-SDS-PAGE patterns (A) and Western blotting (B) of casein hydrolysates

2.2 酪蛋白酶解產(chǎn)物水解度

由圖2可知，酶解4 h后，復合風味蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最高，達到52.88%，表明酪蛋白上有較多的復合風味蛋白酶酶切位點。菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度最低，只有3.19%，與葉挺等[32]研究結(jié)果相同。其他的酶解產(chǎn)物水解度由高到低分別為堿性蛋白酶25.36%、胰凝乳蛋白酶21.46%、中性蛋白酶19.69%、木瓜蛋白酶16.89%、胰蛋白酶8.67%。劉曉宇等[33]采用5 種酶對酪蛋白進行酶解，結(jié)果顯示，經(jīng)過6 h酶解后，復合風味蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度最低（7.1%），而本研究中復合風味蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度遠高于其他各酶，分析原因可能在于蛋白酶來源差異，本研究選取的復合風味蛋白酶具有更好的酶解能力。

圖2 酪蛋白酶解產(chǎn)物的水解度Fig. 2 Degree of hydrolysis of casein hydrolysates

2.3 酪蛋白酶解產(chǎn)物RP-HPLC檢測分析

RP-HPLC是利用蛋白質(zhì)的疏水特性差異進行分離，不同的梯度洗脫速率會影響蛋白質(zhì)分離效果和出峰時間。陡峭的梯度使得洗脫峰尖銳，但分辨率降低；而淺平的梯度能得到相對平緩的峰，但分辨率升高[34]。為了更好分離不同肽段，本研究采用速率更緩、時間更長的梯度洗脫。由圖3可知，酪蛋白原料的出峰時間在52～56 min。

復合風味蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解產(chǎn)物在50～60 min附近沒有峰出現(xiàn)，說明酪蛋白被酶解得較徹底。通常來說，極性強、分子質(zhì)量小的分子擴散快，出峰時間更短[35]。從色譜圖中可以看出，復合風味蛋白酶酶解酪蛋白后的肽段出峰時間集中在20 min之前，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物出峰時間集中在30 min之前，說明復合風味蛋白酶、中性蛋白酶酶解酪蛋白的程度高于其他幾種酶，同時產(chǎn)生了更多親水性多肽。不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布差異很明顯，這是因為不同蛋白酶對酪蛋白的作用位點不同[36]。復合風味蛋白酶在0～20 min出現(xiàn)多個顯著尖峰，表明其產(chǎn)生大量特定分子質(zhì)量的小分子肽，其酶解特異性高于中性蛋白酶。堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均有不同程度的酶解效果，根據(jù)峰型推斷其酶解特異性存在顯著差異，其中木瓜蛋白酶峰型連續(xù)、平緩，酶解特異性最差。菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物在52～56 min依然有很明顯的峰出現(xiàn)，可以判斷出菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶對于酪蛋白的酶解效果不佳，酪蛋白殘留較為明顯。其中胰蛋白酶酶解后峰形較尖，且有多個峰，表明其酶解特異性優(yōu)于菠蘿蛋白酶。綜合HPLC出峰時間和峰型分布得出，酶解效果最佳的為復合風味蛋白酶、中性蛋白酶，其次為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和菠蘿蛋白酶解效果最差。

2.4 酪蛋白酶解產(chǎn)物與IgG和IgE結(jié)合能力的變化

在ic-ELISA中，常用半抑制質(zhì)量濃度（IC50）來表征抗原-抗體結(jié)合能力的強弱，即當競爭抗原的IC50越大，則說明達到半抑制率所需的競爭抗原量越多，即其抗原性越弱。通過ic-ELISA對酪蛋白酶解肽進行與IgG和IgE結(jié)合能力的評估，結(jié)果如圖4所示。通過對圖4的結(jié)果進行擬合，得到酪蛋白酶解肽的IC50如表2所示。通過酶解，酪蛋白與IgG、IgE的結(jié)合能力發(fā)生明顯變化。

表2 酪蛋白酶解產(chǎn)物IC50Table 2 IC50 of casein hydrolysates μg/mL

圖4 酪蛋白酶解產(chǎn)物與IgE（A）和IgG（B）結(jié)合抑制率的變化Fig. 4 Changes in binding ability of casein hydrolysates to IgE (A) and IgG (B)

在與IgE的結(jié)合能力中，未水解酪蛋白IC50=0.42 μg/mL，經(jīng)胰凝乳蛋白酶酶解酪蛋白肽的IC50=72.44 μg/mL，其IgE結(jié)合能力降低為未處理前的1/172，致敏性降低效果最顯著；菠蘿蛋白酶酶解酪蛋白肽的IC50=1.91 μg/mL，其IgE結(jié)合能力降低為未處理前的1/5，致敏性降低效果最弱。復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶酶解產(chǎn)物與IgE的結(jié)合能力分別降低為未處理前的1/117、1/106、1/77、1/70、1/9，致敏性降低效果依次減弱。

在與IgG的結(jié)合能力中，未水解酪蛋白IC50=0.66 μg/mL，經(jīng)復合風味蛋白酶酶解酪蛋白肽的IC50=87.10 μg/mL，與IgG的結(jié)合能力降低為未處理前的1/132，致敏性降低效果最顯著；菠蘿蛋白酶酶解酪蛋白肽的IC50=3.89 μg/mL，其IgG結(jié)合能力降低為未處理前的1/6，致敏性降低效果最弱。堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶酶解產(chǎn)物與IgG的結(jié)合能力分別降低為未處理前的1/105、1/73、1/73、1/60、1/7，致敏性降低效果依次減弱，這與Liang Xiaona等[37]的研究結(jié)果一致。

結(jié)合酪蛋白水解度和酶解產(chǎn)物與IgG和IgE結(jié)合能力的變化可以發(fā)現(xiàn)，水解度與IgG和IgE結(jié)合能力并無嚴格對應規(guī)律。不同蛋白酶水解酪蛋白時，水解度的高低并不能代表殘留過敏原性的高低，二者沒有呈現(xiàn)正向?qū)P系。Van Esch等[38]在評估乳清蛋白水解物致敏性時也獲得了類似的結(jié)果。這主要與不同蛋白酶特異水解酪蛋白的位點有關，酶解位點的不同將會影響酶解酪蛋白抗原結(jié)合表位的效果。

2.5 酪蛋白T細胞表位預測結(jié)果

食物過敏發(fā)生歷程中殘留的特定肽段（T細胞表位）激活T淋巴細胞屬于過敏反應的致敏階段，這是緩解過敏反應的關鍵環(huán)節(jié)[39]。通過獲得酪蛋白過敏原T細胞表位的基本信息，基于此優(yōu)化精準破壞酪蛋白T細胞表位的酶解方案，可以阻斷過敏反應的啟動。通過軟件預測，并將高度重合的序列進行整合，最終獲得16 個酪蛋白T細胞表位，匯總結(jié)果如表3所示。分別獲得4 個αs1-酪蛋白T細胞表位、6 個αs2-酪蛋白T細胞表位、4 個β-酪蛋白T細胞表位和2 個κ-酪蛋白T細胞表位。范安妮等[40]通過IEDB數(shù)據(jù)庫預測αs1-酪蛋白的抗原區(qū)分別為肽鏈的16～29、45～50、52～54、56～70、74～75、77～86、94～104、142～152、173～179和185～210位，與本研究預測結(jié)果高度相似。通過序列的位置進行分析，發(fā)現(xiàn)不同軟件的預測結(jié)果有重疊，其中IEDB和SYFPEITHI預測的結(jié)果與NetMHC（Ⅱ）/pan重復較多，且NetMHC（Ⅱ）/pan預測的結(jié)果更加完整。

表3 酪蛋白T細胞表位預測結(jié)果Table 3 Prediction results of casein T cell epitopes

2.6 胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物中殘留表位肽分析

基于上述實驗結(jié)果，進一步通過質(zhì)譜實驗對胰凝乳蛋白酶酶解酪蛋白后的肽段氨基酸序列進行分析，從中選取屬于酪蛋白的肽段，并分析肽段中殘留的T細胞表位情況，得到的結(jié)果如表4所示。有文獻表明，CD4+T表位長度各異，但其核心結(jié)合殘基只有9 個[41]。通過酶解后的氨基酸序列可知，酪蛋白經(jīng)過胰凝乳蛋白酶酶解后的序列僅剩余1 條大于9 個氨基酸的T細胞表位肽段LHSMKEGIHAQQK，表明酶解消除酪蛋白致敏肽段效果突出。

表4 酪蛋白酶解肽的氨基酸序列信息Table 4 Amino acid sequence of casein hydrolysates

3 結(jié) 論

酶解可以有效降低牛乳酪蛋白致敏性，其中胰凝乳蛋白酶、復合風味蛋白酶降低酪蛋白致敏原性效果最顯著，而菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶降低致敏性效果較弱。分析水解度與致敏性數(shù)據(jù)，沒有發(fā)現(xiàn)正向?qū)P系。酪蛋白經(jīng)過胰凝乳蛋白酶酶解后，僅剩余1 條大于9 個氨基酸的T細胞表位肽段LHSMKEGIHAQQK。胰凝乳蛋白酶和復合風味蛋白酶具備用于制備低致敏酪蛋白產(chǎn)品的潛力，可作為進一步復合酶解的備選酶種，2 種酶解產(chǎn)物的肽段分子特征及理化特性有待進一步深入研究。