張懿翔，張清平，李林顯，王 亮，楊捷琳，劉 洋*

（1 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院/國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（乳及乳制品檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)） 上海 200233 2 吐露港生物科技有限公司 上海 200233 3 上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 上海 200135）

食品安全是關(guān)乎人民生命健康和社會(huì)和諧的重大戰(zhàn)略問題。嬰幼兒配方食品是部分嬰幼兒的唯一食物來源，對(duì)嬰幼兒健康及生命安全有重要影響?？肆_諾桿菌為革蘭氏陰性菌，是一種普遍存在于大自然中的條件致病菌。一旦感染該菌，會(huì)對(duì)嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重危害，可引發(fā)壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病，甚至可能留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達(dá)40%～80%[1-3]。

在嬰幼兒配方乳粉中存在克羅諾桿菌屬高污染風(fēng)險(xiǎn)[4-8]。在生產(chǎn)過程中控制克羅諾桿菌污染是嬰兒配方食品安全控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而快速精確檢測(cè)是其質(zhì)量保證的重要手段。

CRISPR 是指成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式，該序列是許多原核生物的免疫系統(tǒng)[9]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年。ISHINO 等[10]首次在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)串聯(lián)的間隔重復(fù)序列，然而，當(dāng)時(shí)未引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。2002年，Jansen 等[11]將這一奇特的重復(fù)間隔序列正式命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）。CRISPR/Cas 系統(tǒng)本質(zhì)上是一系列由RNA 引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶[12-14]。近年來，CRISPR 技術(shù)在基因組編輯領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值，在分子檢測(cè)、病原菌檢測(cè)，包括最近的新冠檢測(cè)等領(lǐng)域也開始有重要的突破性應(yīng)用[15-22]。本研究使用的Cas12b 屬于第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的Ⅴ型，具有附帶切割活性[23-24]。在靶標(biāo)核酸存在的情況下，Cas 蛋白在crRNA 引導(dǎo)下特異性結(jié)合靶標(biāo)核酸并被激發(fā)出單鏈核酸非特異性切割活性，從而將體系中單鏈核酸報(bào)告分子切開并釋放出可檢測(cè)的信號(hào)。

本研究基于CRISPR-Cas12b 蛋白，利用團(tuán)隊(duì)原創(chuàng)建立的CRISPR-Cas12b 檢測(cè)技術(shù)來建立重要食源性致病菌的分子檢測(cè)方法，對(duì)嬰幼兒配方食品中致病菌克羅諾桿菌屬進(jìn)行快速定性篩選檢測(cè)，這對(duì)提升我國嬰幼兒配方食品企業(yè)質(zhì)量控制能力和民眾關(guān)切的嬰幼兒食品安全水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇8 株克羅諾桿菌屬參比菌株和31 株實(shí)驗(yàn)室分離株，以及30 株非克羅諾桿菌屬的純化標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行特異性檢測(cè)（表1、表2）。

表1 克羅諾桿菌屬陽性菌株名稱及其編號(hào)Table 1 The name and number of positive strains of Cronobacter

表2 克羅諾桿菌屬陰性菌株名稱及其編號(hào)Table 2 The name and number of negative strains of Cronobacter

1.2 儀器與設(shè)備

ABI7500PCR 擴(kuò)增儀、BIO-RADPCR 擴(kuò)增儀，美國BIO-RAD；Vortex Genie2 漩渦振蕩器，美國SI；移液槍，美國GILSON；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化；ESCO LA2-4A1 生物安全柜，新加坡藝思高。

1.3 主要試劑與材料

Phanta?Max Super -Fidelity DNA Polymerase，南京諾唯贊Vazyme，P505-d1；NEBuffer 3.1（10×），NEB，B7203S；UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water，ThermoFisher，10977023；RNA 酶抑制劑，Takara，2313B；Cas12b 蛋白，吐露港生物；細(xì)菌DNA 提取試劑盒DP302-02，天根生化科技（北京）有限公司，U8110。

PCR 引物與探針見表3。

表3 引物與探針Table 3 Primers and probes

2 試驗(yàn)方法

2.1 引物設(shè)計(jì)

通過基因組比較和候選靶點(diǎn)選擇，以16S rRNA 基因保守序列、克羅諾桿菌菌株特異性關(guān)鍵基因序列、編碼致病性相關(guān)基因序列及其他文獻(xiàn)報(bào)道可區(qū)分菌株的特異性序列候選區(qū)域，針對(duì)每個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2～3 對(duì)擴(kuò)增引物和向?qū)NA 靶向序列進(jìn)行生物信息學(xué)測(cè)試，挑選效率最高和特異性最好的組合，通過NCBI 在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，利用Prime Express 軟件V3.0（ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA）設(shè)計(jì)出4 對(duì)引物和向?qū)NA組合，經(jīng)過特異性及靈敏度測(cè)試，最終篩選出1對(duì)，序列見表3。CRISPR 反應(yīng)的報(bào)告探針為12 個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA 序列，在探針的5' 端標(biāo)記FAM，3' 端標(biāo)記Eclipse。所有引物/探針均由上海生工生物有限公司合成，所有RNA 引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.2 核酸提取方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸提取方法 將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)12 h，吸取1 mL 培養(yǎng)液，加入2 mL 無菌離心管中，13 000 r/min，離心5 min，去除上清，重復(fù)上述步驟1 次，即共吸取培養(yǎng)液2 mL 取沉淀。然后根據(jù)試劑盒進(jìn)行提取。

2.2.2 試驗(yàn)樣品核酸提取方法 樣品進(jìn)行前處理：取樣品100 g 加入到900 mL 的BWP 中，混勻，36 ℃培養(yǎng)12 h。取2 mL 的樣品培養(yǎng)液加入2 mL 離心管中13 400 g 離心5 min，而后提取核酸。

我們的工作還存在不少局限。首先，研究中沒有用人類的死亡，而是通過木偶劇表演的動(dòng)物死亡事件來做的研究，其場(chǎng)景和感受可能跟現(xiàn)實(shí)生活中遭遇到死亡事件有所不同。未來的研究需要解決這一可能帶來偏差的問題，嘗試新的測(cè)量方式。由于許多兒童的第一次死亡經(jīng)歷是家庭寵物的死亡(Inagaki & Hatano, 1993)，后面的研究可考慮將這種經(jīng)歷納入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中。

2.3 體系及條件

2.3.1 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系包括25 μL PCR 反應(yīng)混合液，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 聚合酶1 μL，DNA 模板2 μL，用超純水補(bǔ)足總體積為50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃15 s 40 個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。

2.3.2 CRISPR 反應(yīng) 20 μL 的CRISPR 反應(yīng)體系包括：10×NEBuffer 3.1 2 μL，Cas12b（5 μmol/L）1 μL，RNA 酶抑制劑（40 U/μL）0.25 μL，crRNA（10 μmol/L），tracrRNA（10 μmol/L） 和探針（10 μmol/L）各1 μL，待測(cè)DNA 模板2 μL，用超純水補(bǔ)足總體積為20 μL。于ABI7500 熒光PCR 儀（美國，ABI 公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置48 ℃程序，每1 min 檢測(cè)一次FAM 熒光，持續(xù)15 min。

2.4 PCR 擴(kuò)增條件優(yōu)化

以克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸為模板，優(yōu)化擴(kuò)增溫度。退火溫度設(shè)置為54，56，58，60，62 ℃共5 個(gè)溫度梯度，選擇最適合的退火溫度。在此基礎(chǔ)上分別設(shè)置25，30，35，40，45 個(gè)循環(huán)數(shù)。選擇最適宜的循環(huán)數(shù)。

2.5 特異性檢測(cè)

特異性測(cè)試采用8 株克羅諾桿菌屬菌株，31株實(shí)驗(yàn)室分離株和30 株非克羅諾桿菌屬菌株。將表1，表2中所列克羅諾桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株以及其它常見食源性致病菌接種于營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)菌懸液2 mL 提取DNA。對(duì)提取的核酸用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，確保提取核酸的A260/A280在1.8～2.0 之間。利用PCR 對(duì)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，使用CRISPR 反應(yīng)檢測(cè)。

2.6 靈敏度試驗(yàn)

以克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸為模板，對(duì)核酸質(zhì)量濃度分別為100，10，1，0.1，0.01 ng/μL 進(jìn)行檢測(cè)。純菌液檢測(cè)限10 倍梯度稀釋克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）純菌液（107～102CFU/mL），分別吸取2 mL 提取DNA 進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 人工污染樣品的制備

選擇經(jīng)傳統(tǒng)方法和CRISPR 方法驗(yàn)證克羅諾桿菌屬的奶粉樣品作為添加基質(zhì)。取克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）的過夜培養(yǎng)菌懸液分別進(jìn)行10倍梯度稀釋并平板計(jì)數(shù)。同時(shí)?。?0～104CFU/mL稀釋度菌液各1 mL 分別添加到盛有100 g 奶粉樣品的均質(zhì)袋中，另取1 份100 g 奶粉樣品不添加菌液作為空白對(duì)照，上述樣品中加入900 mL BPW 緩沖蛋白胨水，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制成系列含有不同濃度的人工污染樣品。經(jīng)過12 h 的36 ℃增菌，取各樣品勻液2 mL 提取DNA，進(jìn)行CRISPR 檢測(cè)。

2.8 實(shí)際樣品檢驗(yàn)

市場(chǎng)上購買嬰幼兒配方乳粉共51 份。根據(jù)2.2.2 節(jié)進(jìn)行前處理，提取樣品核酸進(jìn)行CRISPR檢測(cè)。并用傳統(tǒng)方法GB 4789.40 進(jìn)行驗(yàn)證。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 擴(kuò)增溫度和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

對(duì)溫度優(yōu)化擴(kuò)增結(jié)果如圖1顯示，58～62 ℃對(duì)于檢測(cè)的結(jié)果影響較小，60 ℃的退火溫度檢測(cè)效果最好，選擇60 ℃作為擴(kuò)增的退火溫度。

圖1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖Fig.1 Result of TM optimization test

圖2 反應(yīng)循環(huán)優(yōu)化結(jié)果圖Fig.2 Result of reaction cycle optimization test

3.2 特異性結(jié)果

特異性檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有克羅諾桿菌屬出現(xiàn)陽性擴(kuò)增信號(hào)，而其它常見食源性致病菌檢測(cè)均沒有明顯擴(kuò)增信號(hào)。表明引物探針組具有良好的特異性，方法適用于克羅諾桿菌屬的特異性檢測(cè)。

圖3 非克羅諾桿菌屬CRISPR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 CRISPR detection results of non Cronobacteria

圖4 克羅諾桿菌屬與分離菌株CRISPR 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 CRISPR detection results of Cronobacteria and its isolatest

3.3 CRISPR 結(jié)果判定

觀察陽性菌株和陰性菌株的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性菌株的熒光信號(hào)隨著反應(yīng)進(jìn)行有明顯的增長趨勢(shì)，而陰性菌株的熒光信號(hào)沒有明顯增長，通過增長趨勢(shì)的差異可以判定檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)crispr檢測(cè)相關(guān)的文獻(xiàn)[17]，定義判定值N 來判斷檢測(cè)結(jié)果。

計(jì)算公式：判定值N=（10 min 樣品熒光值/10 min 對(duì)照熒光值）/（2 min 樣品熒光值/2 min 對(duì)照熒光值）

式中：SF——樣品熒光值；CF——對(duì)照熒光值；對(duì)照熒光值為水的熒光值。

統(tǒng)計(jì)所有結(jié)果，在這69 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)陽性菌株及分離菌株判定值N 均≥1.40，并且有明顯增長趨勢(shì)，陰性菌株結(jié)果均≤1.20，沒有明顯增長趨勢(shì)。對(duì)于1.40～1.20 之間的樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)試，如果N 值＞1.20 判定樣品CRISPR 檢測(cè)篩選陽性，N 值≤1.20 時(shí)，則判定樣品CRISPR 檢測(cè)篩選陰性。通過傳統(tǒng)方法及RT-qPCR 驗(yàn)證結(jié)果均符合預(yù)期。并且當(dāng)檢測(cè)低濃度樣品的時(shí)候（如圖5、圖6、表4）CRISPR 方法更容易判定結(jié)果，陽性樣品的抬頭更明顯。

表4 CT 值與N 值Table 4 CT value and N value

圖5 RT-qPCR 結(jié)果Fig.5 Results of RT-qPCR

3.4 靈敏度檢測(cè)

核酸水平靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖7、表5所示，核酸質(zhì)量濃度在100～0.01 ng/μL 之間判定值N均＞1.2，判定為陽性。純菌液檢測(cè)結(jié)果如圖6、表6所示，除102CFU/g 的純菌液檢測(cè)結(jié)果≤1.2 以外，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果均＞1.2，可以穩(wěn)定檢測(cè)到103CFU/g的純菌液。

表5 CRISPR 檢測(cè)靈敏度判定值結(jié)果Table 5 CRISPR sensitivity test N value results

表6 CRISPR 檢測(cè)純菌液判定值結(jié)果Table 6 Pure bacterial solution test N value results

圖6 純菌液CRISPR 檢測(cè)結(jié)果Fig.6 CRISPR test results of pure bacterial solution

圖7 CRISPR 檢測(cè)靈敏度結(jié)果Fig.7 CRISPR sensitivity test results

3.5 人工污染樣品的檢測(cè)

根據(jù)添加菌液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果，估計(jì)人工污染樣品中克羅諾桿菌屬初始含量為＜10～104CFU/g。經(jīng)過12 h 的增菌，將人工污染樣品中提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 個(gè)不同污染水平的奶粉樣品均呈陽性擴(kuò)增（圖8、表7）。

表7 CRISPR 方法對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Results of artificially contaminated samples

圖8 CRISPR 方法對(duì)人工污染樣品的檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Results of artificially contaminated samples

3.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)市售的51 份樣品進(jìn)行CRISPR 檢測(cè)，結(jié)果顯示全部樣品的判定值N≤1.20，均為陰性，未檢出克羅諾桿菌屬與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致。

4 討論與結(jié)論

嬰幼兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染風(fēng)險(xiǎn)控制是乳粉生產(chǎn)質(zhì)量控制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，目前，食品克羅諾桿菌屬檢測(cè)方法主要是常規(guī)的培養(yǎng)法、熒光PCR 法、環(huán)等溫?cái)U(kuò)增法等檢測(cè)方法。這些技術(shù)在靈敏度、特異性、簡(jiǎn)便性、速度和價(jià)格上各有優(yōu)劣，但仍有容易污染、需要大型擴(kuò)增設(shè)備等缺陷[25-30]。

目前主要使用的傳統(tǒng)檢測(cè)方法如GB 4789.40-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》能得到食品樣本中克羅諾桿菌的定性和定量測(cè)定結(jié)果，但都需經(jīng)富集培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定等過程，操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)過程至少需要4～7 d，而且靈敏度低，容易發(fā)生錯(cuò)檢和漏檢，無法對(duì)人工難以培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行檢測(cè)。

本研究使用的CRISPR 的檢測(cè)技術(shù)被譽(yù)為“下一代的分子檢測(cè)技術(shù)”，能做到“快速、靈敏、高特異、簡(jiǎn)便、低價(jià)”的特性，所建立的檢測(cè)方法特異性高，方法檢出限為＜10 CFU/100 g，實(shí)際樣品檢驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。本研究也是CRISPR 檢測(cè)技術(shù)在國際食品安全領(lǐng)域方面的創(chuàng)新性技術(shù)開拓和應(yīng)用探索，是國際首次將該技術(shù)在食品安全領(lǐng)域進(jìn)行的創(chuàng)新性研究及應(yīng)用，將對(duì)我國食品安全檢測(cè)能力提升產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，提高我國在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的國際話語權(quán)，具有重要意義，因此具有良好的應(yīng)用前景。在之后的研究中，可以使用該技術(shù)與其它檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步提升其檢測(cè)速度，靈敏度，提升我國在快速檢測(cè)領(lǐng)域的能力。