張懿翔，張清平，李林顯，王 亮，楊捷琳，劉 洋*

（1 上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院/國家市場監(jiān)管重點實驗室（乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術） 上海 200233 2 吐露港生物科技有限公司 上海 200233 3 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心 上海 200135）

食品安全是關乎人民生命健康和社會和諧的重大戰(zhàn)略問題。嬰幼兒配方食品是部分嬰幼兒的唯一食物來源，對嬰幼兒健康及生命安全有重要影響?？肆_諾桿菌為革蘭氏陰性菌，是一種普遍存在于大自然中的條件致病菌。一旦感染該菌，會對嬰幼兒的健康造成嚴重危害，可引發(fā)壞死性小腸結腸炎、菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病，甚至可能留下嚴重的神經系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達40%～80%[1-3]。

在嬰幼兒配方乳粉中存在克羅諾桿菌屬高污染風險[4-8]。在生產過程中控制克羅諾桿菌污染是嬰兒配方食品安全控制的關鍵環(huán)節(jié)，而快速精確檢測是其質量保證的重要手段。

CRISPR 是指成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），是大多數(shù)細菌及古細菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式，該序列是許多原核生物的免疫系統(tǒng)[9]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年。ISHINO 等[10]首次在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)串聯(lián)的間隔重復序列，然而，當時未引起學術界的關注。2002年，Jansen 等[11]將這一奇特的重復間隔序列正式命名為串聯(lián)間隔短回文重復序列（CRISPR）。CRISPR/Cas 系統(tǒng)本質上是一系列由RNA 引導的核酸內切酶[12-14]。近年來，CRISPR 技術在基因組編輯領域表現(xiàn)出巨大的應用價值，在分子檢測、病原菌檢測，包括最近的新冠檢測等領域也開始有重要的突破性應用[15-22]。本研究使用的Cas12b 屬于第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的Ⅴ型，具有附帶切割活性[23-24]。在靶標核酸存在的情況下，Cas 蛋白在crRNA 引導下特異性結合靶標核酸并被激發(fā)出單鏈核酸非特異性切割活性，從而將體系中單鏈核酸報告分子切開并釋放出可檢測的信號。

本研究基于CRISPR-Cas12b 蛋白，利用團隊原創(chuàng)建立的CRISPR-Cas12b 檢測技術來建立重要食源性致病菌的分子檢測方法，對嬰幼兒配方食品中致病菌克羅諾桿菌屬進行快速定性篩選檢測，這對提升我國嬰幼兒配方食品企業(yè)質量控制能力和民眾關切的嬰幼兒食品安全水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇8 株克羅諾桿菌屬參比菌株和31 株實驗室分離株，以及30 株非克羅諾桿菌屬的純化標準菌株進行特異性檢測（表1、表2）。

表1 克羅諾桿菌屬陽性菌株名稱及其編號Table 1 The name and number of positive strains of Cronobacter

表2 克羅諾桿菌屬陰性菌株名稱及其編號Table 2 The name and number of negative strains of Cronobacter

1.2 儀器與設備

ABI7500PCR 擴增儀、BIO-RADPCR 擴增儀，美國BIO-RAD；Vortex Genie2 漩渦振蕩器，美國SI；移液槍，美國GILSON；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化；ESCO LA2-4A1 生物安全柜，新加坡藝思高。

1.3 主要試劑與材料

Phanta?Max Super -Fidelity DNA Polymerase，南京諾唯贊Vazyme，P505-d1；NEBuffer 3.1（10×），NEB，B7203S；UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water，ThermoFisher，10977023；RNA 酶抑制劑，Takara，2313B；Cas12b 蛋白，吐露港生物；細菌DNA 提取試劑盒DP302-02，天根生化科技（北京）有限公司，U8110。

PCR 引物與探針見表3。

表3 引物與探針Table 3 Primers and probes

2 試驗方法

2.1 引物設計

通過基因組比較和候選靶點選擇，以16S rRNA 基因保守序列、克羅諾桿菌菌株特異性關鍵基因序列、編碼致病性相關基因序列及其他文獻報道可區(qū)分菌株的特異性序列候選區(qū)域，針對每個區(qū)域設計2～3 對擴增引物和向導RNA 靶向序列進行生物信息學測試，挑選效率最高和特異性最好的組合，通過NCBI 在線工具進行序列分析和比對，利用Prime Express 軟件V3.0（ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA）設計出4 對引物和向導RNA組合，經過特異性及靈敏度測試，最終篩選出1對，序列見表3。CRISPR 反應的報告探針為12 個隨機序列的單鏈DNA 序列，在探針的5' 端標記FAM，3' 端標記Eclipse。所有引物/探針均由上海生工生物有限公司合成，所有RNA 引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.2 核酸提取方法

2.2.1 標準菌株核酸提取方法 將標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)12 h，吸取1 mL 培養(yǎng)液，加入2 mL 無菌離心管中，13 000 r/min，離心5 min，去除上清，重復上述步驟1 次，即共吸取培養(yǎng)液2 mL 取沉淀。然后根據(jù)試劑盒進行提取。

2.2.2 試驗樣品核酸提取方法 樣品進行前處理：取樣品100 g 加入到900 mL 的BWP 中，混勻，36 ℃培養(yǎng)12 h。取2 mL 的樣品培養(yǎng)液加入2 mL 離心管中13 400 g 離心5 min，而后提取核酸。

我們的工作還存在不少局限。首先，研究中沒有用人類的死亡，而是通過木偶劇表演的動物死亡事件來做的研究，其場景和感受可能跟現(xiàn)實生活中遭遇到死亡事件有所不同。未來的研究需要解決這一可能帶來偏差的問題，嘗試新的測量方式。由于許多兒童的第一次死亡經歷是家庭寵物的死亡(Inagaki & Hatano, 1993)，后面的研究可考慮將這種經歷納入實驗設計中。

2.3 體系及條件

2.3.1 PCR 反應 反應體系包括25 μL PCR 反應混合液，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 聚合酶1 μL，DNA 模板2 μL，用超純水補足總體積為50 μL。擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃20 s，60 ℃20 s，72 ℃15 s 40 個循環(huán)；4 ℃保存。

2.3.2 CRISPR 反應 20 μL 的CRISPR 反應體系包括：10×NEBuffer 3.1 2 μL，Cas12b（5 μmol/L）1 μL，RNA 酶抑制劑（40 U/μL）0.25 μL，crRNA（10 μmol/L），tracrRNA（10 μmol/L） 和探針（10 μmol/L）各1 μL，待測DNA 模板2 μL，用超純水補足總體積為20 μL。于ABI7500 熒光PCR 儀（美國，ABI 公司）上進行擴增，設置48 ℃程序，每1 min 檢測一次FAM 熒光，持續(xù)15 min。

2.4 PCR 擴增條件優(yōu)化

以克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）標準菌株核酸為模板，優(yōu)化擴增溫度。退火溫度設置為54，56，58，60，62 ℃共5 個溫度梯度，選擇最適合的退火溫度。在此基礎上分別設置25，30，35，40，45 個循環(huán)數(shù)。選擇最適宜的循環(huán)數(shù)。

2.5 特異性檢測

特異性測試采用8 株克羅諾桿菌屬菌株，31株實驗室分離株和30 株非克羅諾桿菌屬菌株。將表1，表2中所列克羅諾桿菌屬標準菌株以及其它常見食源性致病菌接種于營養(yǎng)肉湯中，36 ℃培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)菌懸液2 mL 提取DNA。對提取的核酸用超微量分光光度計進行濃度和純度的測定，確保提取核酸的A260/A280在1.8～2.0 之間。利用PCR 對菌株DNA 進行擴增，使用CRISPR 反應檢測。

2.6 靈敏度試驗

以克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）標準菌株核酸為模板，對核酸質量濃度分別為100，10，1，0.1，0.01 ng/μL 進行檢測。純菌液檢測限10 倍梯度稀釋克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）純菌液（107～102CFU/mL），分別吸取2 mL 提取DNA 進行檢測。

2.7 人工污染樣品的制備

選擇經傳統(tǒng)方法和CRISPR 方法驗證克羅諾桿菌屬的奶粉樣品作為添加基質。取克羅諾桿菌屬（ATCC 25944）的過夜培養(yǎng)菌懸液分別進行10倍梯度稀釋并平板計數(shù)。同時?。?0～104CFU/mL稀釋度菌液各1 mL 分別添加到盛有100 g 奶粉樣品的均質袋中，另取1 份100 g 奶粉樣品不添加菌液作為空白對照，上述樣品中加入900 mL BPW 緩沖蛋白胨水，用拍擊式均質器拍擊2 min，制成系列含有不同濃度的人工污染樣品。經過12 h 的36 ℃增菌，取各樣品勻液2 mL 提取DNA，進行CRISPR 檢測。

2.8 實際樣品檢驗

市場上購買嬰幼兒配方乳粉共51 份。根據(jù)2.2.2 節(jié)進行前處理，提取樣品核酸進行CRISPR檢測。并用傳統(tǒng)方法GB 4789.40 進行驗證。

3 試驗結果

3.1 擴增溫度和循環(huán)數(shù)的優(yōu)化結果

對溫度優(yōu)化擴增結果如圖1顯示，58～62 ℃對于檢測的結果影響較小，60 ℃的退火溫度檢測效果最好，選擇60 ℃作為擴增的退火溫度。

圖1 退火溫度優(yōu)化結果圖Fig.1 Result of TM optimization test

圖2 反應循環(huán)優(yōu)化結果圖Fig.2 Result of reaction cycle optimization test

3.2 特異性結果

特異性檢測結果如圖3、圖4所示，結果發(fā)現(xiàn)所有克羅諾桿菌屬出現(xiàn)陽性擴增信號，而其它常見食源性致病菌檢測均沒有明顯擴增信號。表明引物探針組具有良好的特異性，方法適用于克羅諾桿菌屬的特異性檢測。

圖3 非克羅諾桿菌屬CRISPR 檢測結果Fig.3 CRISPR detection results of non Cronobacteria

圖4 克羅諾桿菌屬與分離菌株CRISPR 檢測結果Fig.4 CRISPR detection results of Cronobacteria and its isolatest

3.3 CRISPR 結果判定

觀察陽性菌株和陰性菌株的檢測結果發(fā)現(xiàn)，陽性菌株的熒光信號隨著反應進行有明顯的增長趨勢，而陰性菌株的熒光信號沒有明顯增長，通過增長趨勢的差異可以判定檢測結果。根據(jù)crispr檢測相關的文獻[17]，定義判定值N 來判斷檢測結果。

計算公式：判定值N=（10 min 樣品熒光值/10 min 對照熒光值）/（2 min 樣品熒光值/2 min 對照熒光值）

式中：SF——樣品熒光值；CF——對照熒光值；對照熒光值為水的熒光值。

統(tǒng)計所有結果，在這69 個標準菌株的結果中，發(fā)現(xiàn)陽性菌株及分離菌株判定值N 均≥1.40，并且有明顯增長趨勢，陰性菌株結果均≤1.20，沒有明顯增長趨勢。對于1.40～1.20 之間的樣品進行重復測試，如果N 值＞1.20 判定樣品CRISPR 檢測篩選陽性，N 值≤1.20 時，則判定樣品CRISPR 檢測篩選陰性。通過傳統(tǒng)方法及RT-qPCR 驗證結果均符合預期。并且當檢測低濃度樣品的時候（如圖5、圖6、表4）CRISPR 方法更容易判定結果，陽性樣品的抬頭更明顯。

表4 CT 值與N 值Table 4 CT value and N value

圖5 RT-qPCR 結果Fig.5 Results of RT-qPCR

3.4 靈敏度檢測

核酸水平靈敏度檢測結果如圖7、表5所示，核酸質量濃度在100～0.01 ng/μL 之間判定值N均＞1.2，判定為陽性。純菌液檢測結果如圖6、表6所示，除102CFU/g 的純菌液檢測結果≤1.2 以外，重復檢測結果均＞1.2，可以穩(wěn)定檢測到103CFU/g的純菌液。

表5 CRISPR 檢測靈敏度判定值結果Table 5 CRISPR sensitivity test N value results

表6 CRISPR 檢測純菌液判定值結果Table 6 Pure bacterial solution test N value results

圖6 純菌液CRISPR 檢測結果Fig.6 CRISPR test results of pure bacterial solution

圖7 CRISPR 檢測靈敏度結果Fig.7 CRISPR sensitivity test results

3.5 人工污染樣品的檢測

根據(jù)添加菌液的平板計數(shù)結果，估計人工污染樣品中克羅諾桿菌屬初始含量為＜10～104CFU/g。經過12 h 的增菌，將人工污染樣品中提取的DNA進行擴增檢測。結果發(fā)現(xiàn)4 個不同污染水平的奶粉樣品均呈陽性擴增（圖8、表7）。

表7 CRISPR 方法對人工污染樣品的檢測結果Table 7 Results of artificially contaminated samples

圖8 CRISPR 方法對人工污染樣品的檢測結果Fig.8 Results of artificially contaminated samples

3.6 實際樣品檢測

對市售的51 份樣品進行CRISPR 檢測，結果顯示全部樣品的判定值N≤1.20，均為陰性，未檢出克羅諾桿菌屬與傳統(tǒng)方法檢測結果一致。

4 討論與結論

嬰幼兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染風險控制是乳粉生產質量控制中的一個重要環(huán)節(jié)，目前，食品克羅諾桿菌屬檢測方法主要是常規(guī)的培養(yǎng)法、熒光PCR 法、環(huán)等溫擴增法等檢測方法。這些技術在靈敏度、特異性、簡便性、速度和價格上各有優(yōu)劣，但仍有容易污染、需要大型擴增設備等缺陷[25-30]。

目前主要使用的傳統(tǒng)檢測方法如GB 4789.40-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》能得到食品樣本中克羅諾桿菌的定性和定量測定結果，但都需經富集培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定等過程，操作復雜、耗時費力，檢測過程至少需要4～7 d，而且靈敏度低，容易發(fā)生錯檢和漏檢，無法對人工難以培養(yǎng)的致病菌進行檢測。

本研究使用的CRISPR 的檢測技術被譽為“下一代的分子檢測技術”，能做到“快速、靈敏、高特異、簡便、低價”的特性，所建立的檢測方法特異性高，方法檢出限為＜10 CFU/100 g，實際樣品檢驗結果與預期結果相符。本研究也是CRISPR 檢測技術在國際食品安全領域方面的創(chuàng)新性技術開拓和應用探索，是國際首次將該技術在食品安全領域進行的創(chuàng)新性研究及應用，將對我國食品安全檢測能力提升產生深遠影響，提高我國在食品安全檢測領域的國際話語權，具有重要意義，因此具有良好的應用前景。在之后的研究中，可以使用該技術與其它檢測技術聯(lián)合應用，進一步提升其檢測速度，靈敏度，提升我國在快速檢測領域的能力。