遲濤，方景泉，滿朝新，許慧

（1.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150028；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150028）

0 引言

克羅諾桿菌（原名阪崎腸桿菌）屬于腸桿科，是一種周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞機(jī)會(huì)性致病菌，能夠感染嬰兒和成人[1,2]。更重要的是，克羅諾桿菌屬于嬰兒配方乳粉（PIF）中的A類致病菌，新生兒尤其是體重較輕的早產(chǎn)兒攝入被克羅諾桿菌污染的PIF后，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，死亡率高達(dá)40%～80%[3-5]?？肆_諾桿菌的鑒定方法有很多，如顯色培養(yǎng)基和API2.0E系統(tǒng)，然而這些根據(jù)克羅諾桿菌理化性質(zhì)建立的鑒定方法不能從分子生物學(xué)角度對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定[6]。本研究利用16S rRNA及看家基因fusA從分子生物學(xué)角度對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，并比較這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，從而為克羅諾桿菌的鑒定提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：本實(shí)驗(yàn)保存的分離自嬰兒配方乳粉的11株克羅諾桿菌，并選擇陰溝腸桿菌ATCC 35030、產(chǎn)期腸桿菌ATCC 3048、大腸桿菌O157和大腸桿菌CMCCB 44113作為參考株。

主要試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB），胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），瓊脂糖，分子試劑，細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒，2×Taq PCR Master Mix（含染料），雙蒸水。

主要儀器：QT-1型旋渦混合器，水浴鍋，PL203型電子分析天平，潔凈工作臺(tái)VD-1320，DYY-10C型電泳儀，UVP凝膠呈相系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 克羅諾桿菌的活化與純化

取出-20℃甘油保存的含有克羅諾桿菌的凍存管，將菌株恢復(fù)至室溫后，按2%的接種量接種于NB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8～12 h進(jìn)行活化。若菌株為單一菌體，活化后即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，若活化菌株不純需進(jìn)行純化后才能進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，即將活化后的菌株在TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落，置于10 mL液體NB培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，連續(xù)傳代2次后即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 克羅諾桿菌DNA的提取

取2 mL克羅諾桿菌的NB培養(yǎng)液，按照天根細(xì)菌全基因組DNA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行克羅諾桿菌DNA的提取，并將提取的DNA置與-20℃冰箱中保藏備用。

1.2.3 克羅諾桿菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增

以克羅諾桿菌總DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表2-1。PCR的反應(yīng)體積為50 μL，反應(yīng)體系為：模板2 L，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 uL，雙蒸水21 uL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 S，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸7 min。樣品置于4℃冰箱內(nèi)保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

表1 引物序列

1.2.4 克羅諾桿菌fusA基因的PCR擴(kuò)增

以克羅諾桿菌總DNA為模板，利用fusA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1所示。PCR的反應(yīng)體積為50 μL，反應(yīng)體系為：模板2 uL，上下游引物各1 uL，2×Taq PCR Master Mix（含染料）25 μL，雙蒸水21 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min[6]。樣品置于4℃冰箱內(nèi)保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.2.5 克羅諾桿菌生物信息學(xué)分析

將PCR產(chǎn)物送往，進(jìn)行基因測(cè)序，得到克羅諾桿菌的序列。將16 S rRNA的序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行克羅諾桿菌的鑒定；將fusA的序列在克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)（http：//pubmlst.org/cronobacter/）得到fusA基因的等位基因號(hào)。并利用MEGA6軟件對(duì)克羅諾桿菌的16S rRNA和fusA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選用最大似然算法，重復(fù)1 000次[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 克羅諾桿菌16S rRNA的分析

將克羅諾桿菌16S rRNA的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，11株克羅諾桿菌的比對(duì)結(jié)果如表2所示；利用MEGA6軟件對(duì)11株和4株參考株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由表2可以看出，11株菌株中9株被鑒定為阪崎克羅諾桿菌，而編號(hào)為7和11的菌株經(jīng)過(guò)blast比對(duì)，為阪崎克羅諾桿菌和丙二酸陽(yáng)性克羅尼桿菌的可能都為99%。通過(guò)11株克羅諾桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，利用16S rRNA的通用引物對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行分析，可以很好的與其他血緣相近的微生物區(qū)分，但是在克羅諾桿菌內(nèi)的辨識(shí)度不強(qiáng)，呈現(xiàn)相近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

表2 11株克羅諾桿菌NCBI比對(duì)結(jié)果

圖1 11株克羅諾桿菌16S rRNA最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 克羅諾桿菌fusA基因的分析

將克羅諾桿菌fusA的測(cè)序結(jié)果在克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，11株克羅諾桿菌fusA的等位基因號(hào)分別為1，7，8，11，12，13，14，15，16，17和37；其中根據(jù)比對(duì)9株為阪崎克羅諾桿菌，2株為丙二酸陽(yáng)性克羅諾桿菌。利用MEGA6軟件對(duì)11株和4參考株的fusA基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。圖2呈現(xiàn)出了清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中等位基因fusA為7和13的丙二酸陽(yáng)性克羅諾桿菌在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中遠(yuǎn)離了阪崎克羅諾桿菌，這說(shuō)明利用fusA基因可以將克羅諾桿菌進(jìn)行種種之間的鑒定。

圖2 11株克羅諾桿菌fusA基因最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 兩種鑒定方法的比較

16S rRNA是傳統(tǒng)的微生物鑒定的分子方法，與基于理化檢驗(yàn)的鑒定方法相比，它具有其自身的優(yōu)越性。16S rRNA的分子鑒定方法是基因微生物16S rRNA序列排列的，可以從分子層面對(duì)微生物進(jìn)行定性分析。然而，由于16S rRNA的特異性不強(qiáng)且多樣性并不豐富，很難將待鑒定的微生物精確到種的水平，且容易產(chǎn)生誤差[9]。由于克羅諾桿菌不同種之間最少的共享性，fusA基因可以用來(lái)克羅諾桿菌的鑒定，并且利用fusA基因?qū)?25株克羅諾桿菌進(jìn)行了鑒定，并且區(qū)分到了種的水平[8]。此外xXiaoke Xu等人也利用fusA基因?qū)肆_諾桿菌進(jìn)行了鑒定，基于fusA的鑒定方法越來(lái)越被人們認(rèn)可[10]。本研究選取了具有代表意義的克羅諾桿菌進(jìn)行了鑒定，其中利用16S rRNA的鑒定方法不能將11株克羅諾桿菌精確到種，而基于fusA的鑒定方法能將克羅諾桿菌精確到種，這也證明了看家基因fusA在克羅諾桿菌的分子鑒定中具有優(yōu)越性。

3 結(jié)論

克羅諾桿菌具有感染嬰兒和成人的能力，能夠通過(guò)污染嬰兒配方乳粉感染新生兒，尤其是體重較輕的早產(chǎn)兒，一旦被感染會(huì)引起嚴(yán)重的壞死性小腸結(jié)腸炎、膿血癥、腦膜炎等疾病，嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康。

本實(shí)驗(yàn)選取11株分離自嬰兒配方乳粉中的克羅諾桿菌為研究對(duì)象，利用16S rRNA和看家基因fusA對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行分子層面的鑒定，并得到了兩者清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明兩種分子鑒定的方法都能對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，且基于看家基因fusA的鑒定方法具有更高的辨識(shí)度，能將克羅諾桿菌的鑒定精確到種。因此利用看家基因fusA對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行分子鑒定具有優(yōu)越性，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于克羅諾桿菌的分子鑒定，為克羅諾桿菌的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。

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