杜亞軍

（山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,太原030031）

0 引言

人體腸道菌群的微生態(tài)平衡與健康密切相關，腸道菌群包括益生菌和潛在致病菌[1]。人體腸道益生菌的數(shù)量隨年齡增大而逐漸減少，益生菌活菌制劑保存性差，活菌攝入機體后在腸道中難以定植，補充益生菌的效果降低，采用促進益生菌增殖的物質(zhì)來提高體內(nèi)益生菌將是一條更易被接受的途徑[2]。近年來人們的注意力逐漸從生產(chǎn)益生菌活菌制劑向益生菌增殖因子的研究生產(chǎn)轉移[3]。

水溶性膳食纖維選擇性地刺激益生菌的生長和活力，從而使益生菌增殖[4]。本項目研究低聚糖等多種水溶性膳食纖維對腸道益生菌選擇性促進生長作用，探討水溶性膳食纖維在調(diào)節(jié)人體微生態(tài)環(huán)境，提高免疫力、抗氧化、延緩衰老方面的保健功效。

1 實驗

1.1 儀器與設備

無菌工作臺，YXQG02型電熱式蒸汽消毒鍋，HG101-2型電熱鼓風干燥箱，HG303-3型電熱恒溫培養(yǎng)箱，HZS-HA水浴振蕩器，DZKW型電子恒溫水浴鍋，

CJJ-78型磁力電熱攪拌器，721型分光光度計，PHS-3C型精密pH計，BS110S電子分析天平。

1.1 水溶性膳食纖維原料及其培養(yǎng)液的制備

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharid），燕麥β-葡聚糖（Oat branβ-glucan,實驗室自制），瓜爾豆膠（Guar gan）,亞麻籽膠（Linseed gun）,果膠（Pectin）,甜菊糖（Stevioside）， 聚葡糖（Pdgdextrosel）。

水溶性膳食纖維培養(yǎng)液的制備：將各水溶性膳食纖維用蒸餾水溶解后配成一定濃度的溶液備用。

1.2 培養(yǎng)基

采用MRS培養(yǎng)基為雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基（配方見表1）[5]，MRS＃培養(yǎng)基為嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基為大腸桿菌增殖培養(yǎng)基。MRS＃培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加了促進生長物質(zhì)碳酸鈣質(zhì)量濃度20 g/L，其中葡萄糖質(zhì)量濃度為7.5 g/L。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的鑒別培養(yǎng)基為改良MRS固體培養(yǎng)基[6]，大腸桿菌的鑒別培養(yǎng)基為EMB固體培養(yǎng)基。改良MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加了X-Gal（Amresco 0428）0.06 g/L（質(zhì)量濃度）。

1.3 方法

1.3.1 菌體生長量的測定

增殖液生長量的測定采用濁度法,用分光光度計測定菌液的OD值，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌測定增殖液在660 nm的OD值，大腸桿菌測定增殖液在600 nm的OD值。

表1 MRS、MRS＃培養(yǎng)基組分 g·L-1

1.3.2 菌液PH值的測定

用PHS-3C型精密pH計在室溫下測定pH值。

1.3.3 計數(shù)方法

采用平板計數(shù)法。用無菌水將樣品稀釋至一定稀釋度，涂布平板，每個樣品涂布3個平板，培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)。

每毫升培養(yǎng)液中的菌數(shù)=3個平板培養(yǎng)基菌落總數(shù)/3×10×培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù)。

1.4 菌種及菌種的活化

兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）凍干菌種，由中國科學院微生物所引入。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）凍干菌種，菌號ATCC6075,中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心購買。大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）試管斜面菌種，由山西大學資源與環(huán)境學院引入。

2 結果與分析

2.1 各種水溶性膳食纖維對腸道菌群生長的影響

分別以質(zhì)量分數(shù)為0.75%的低聚糖、瓜爾豆膠、燕麥β-葡聚糖、亞麻籽膠、果膠、甜菊糖、和聚葡糖取代培養(yǎng)基葡萄糖，作為唯一的培養(yǎng)基碳源，不加水溶性膳食纖維和葡萄糖的相同培養(yǎng)基作為對照，樣品和對照進行接種培養(yǎng)。在MRS培養(yǎng)基中以質(zhì)量分數(shù)為5%的接種量接種雙歧桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測定雙歧桿菌的生長量和pH值。在MRS＃培養(yǎng)基中以質(zhì)量分數(shù)為5%的接種量接種嗜酸乳桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測定嗜酸乳桿菌的生長量和pH值。在LB培養(yǎng)基中以1%的接種量接種大腸桿菌，37℃水浴震蕩培養(yǎng)12 h后測定大腸桿菌的生長量。結果表明，7種水溶性膳食纖維都對雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌都有顯著的促進生長作用，各種水溶性膳食纖維液的促進生長作用顯著性大小不同，作為培養(yǎng)基的唯一碳源，水溶性膳食纖維液濃度為0.75%時，對雙歧桿菌的促生長作用顯著性大小排序如下：瓜爾豆膠＞亞麻籽膠＞燕麥β-葡聚糖＞果膠＞甜菊糖＞低聚異麥芽糖＞聚葡糖，雙歧桿菌的生長量是對照的5.48～2.36倍。對嗜酸乳桿菌的促生長作用顯著性大小排序如下：果膠＞瓜爾豆膠＞亞麻籽膠＞低聚異麥芽糖＞燕麥β-葡聚糖＞聚葡糖＞甜菊糖，嗜酸乳桿菌的生長量是對照的3.79～1.61倍。除了添加燕麥β-葡聚糖、低聚異麥芽糖和聚葡糖的培養(yǎng)基，大腸桿菌生長量略有增加外（分別是對照的1.53倍、1.38倍和1.22倍），其它水溶性膳食纖維培養(yǎng)基中大腸桿菌生長量與對照相比沒有增加，水溶性膳食纖維對大腸桿菌沒有促生長作用。各種水溶性膳食纖維對腸道菌群生長的影響如表2所示。

2.2 水溶性膳食纖維對腸道菌群生長的影響

2.2.1 對雙歧桿菌生長的影響

實驗一：以質(zhì)量分數(shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維分別取代MRS培養(yǎng)基中葡萄糖，作為培養(yǎng)基的唯一碳源進行實驗；實驗二：在MRS培養(yǎng)基中直接加入質(zhì)量分數(shù)為0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維液進行實驗（培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維）。以上培養(yǎng)基接入5%的雙歧桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測定其生長量和pH值。結果表明，培養(yǎng)基中不論是否含葡萄糖，在一定質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，雙歧桿菌生長量也顯著增加，而pH值在逐漸減少。當培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維時（實驗二），由于葡萄糖也可促進雙歧桿菌的生長，水溶性膳食纖維和葡萄糖對雙歧桿菌的促生長作用互相疊加，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，雙歧桿菌生長量增加不如培養(yǎng)基碳源為葡萄糖實驗（實驗一）明顯，在水溶性膳食纖維液達到一定濃度時，隨質(zhì)量分數(shù)的增加，對雙歧桿菌的促生長作用不再增加（如低聚異麥芽糖和聚葡糖）。水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對雙歧桿菌生長的影響如表3和表4所示。

表2 各種水溶性膳食纖維對腸道菌群生長的影響

2.2.2 水溶性膳食纖維濃度對嗜酸乳桿菌生長的影響

實驗一：以質(zhì)量分數(shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維分別取代MRS＃培養(yǎng)基的葡萄糖，作為培養(yǎng)基的唯一碳源進行實驗；實驗二：在MRS＃培養(yǎng)基中直接加入質(zhì)量分數(shù)為0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維液進行實驗（培養(yǎng)基碳源為2%葡萄糖和水溶性膳食纖維）；以上培養(yǎng)基接入5%的嗜酸乳桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測定其生長量和pH值。結果表明，培養(yǎng)基中不論是否含葡萄糖，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，嗜酸乳桿菌生長量也顯著增加，而pH值在逐漸減少。當培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維時（實驗二），由于葡萄糖也可促進嗜酸乳桿菌的生長，水溶性膳食纖維和葡萄糖對嗜酸乳桿菌的促生長作用互相疊加，隨著水溶性膳食纖維液質(zhì)量分數(shù)的增加，嗜酸乳桿菌生長量增加不如培養(yǎng)基碳源為葡萄糖實驗（實驗一）明顯，在水溶性膳食纖維液達到一定質(zhì)量分數(shù)時，隨質(zhì)量分數(shù)的增加，對嗜酸乳桿菌的促生長作用不再增加（如甜菊糖）。水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對嗜酸乳桿菌生長的影響如表5和表6所示。

2.2.3 水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對大腸桿菌生長的影響

在LB培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分數(shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維，接入1%大腸桿菌，37℃水浴震蕩培養(yǎng)12 h后測定其生長量。結果表明，隨濃度的增加，水溶性膳食纖維對大腸桿菌生長影響較小，生長量增加不明顯，水溶性膳食纖維隨濃度增加，對大腸桿菌沒有促生長作用。水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對大腸桿菌生長的影響如表7所示。

2.3 體外競爭試驗

將3種不同的腸道細菌菌株按同樣比例接種于同一瓶分別以7種水溶性膳食纖維為唯一碳源的MRS液體培養(yǎng)基中,混合培養(yǎng)16 h后取樣,分別測定益生菌和大腸桿菌的菌落數(shù)。有益菌的計數(shù)：樣品涂布改良MRS平板后，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)。雙歧桿菌菌落為深藍色，菌落呈現(xiàn)圓型，較致密。嗜酸乳桿菌菌落為淺藍色，菌落扁平狀，邊緣不整齊，不透明。大腸桿菌的計數(shù)：樣品涂布EMB平板后，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，選擇具有金屬光澤的紫黑色菌落計數(shù)。

結果表明，益生菌在生長中占絕對優(yōu)勢，水溶性膳食纖維液濃度為0.75%時，7種水溶性膳食纖維培養(yǎng)液中，益生菌的菌落數(shù)都顯著高于大腸桿菌菌落數(shù)（見圖6），益生菌的菌落數(shù)比大腸桿菌高出103.57到101.59 mL-1（見表8），這說明水溶性膳食纖維可選擇性促進益生菌生長,益生菌的增殖又可對大腸桿菌的生長起一定的抑制作用。腸道益生菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)如表8和圖1所示。

3 討論

體外實驗結果顯示：無論是作為培養(yǎng)基唯一的碳源或添加到含葡萄糖的培養(yǎng)基中，7種水溶性膳食纖維都對雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌有顯著促進生長作用，葡萄糖也可促進雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的生長，但葡萄糖到達結腸前，已大都被小腸吸收，不會被腸道益生菌所利用。7種水溶性膳食纖維對大腸桿菌沒有促生長作用。競爭試驗結果顯示：7種水溶性膳食纖維可顯著地促進雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的生長，而雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖又可對大腸桿菌的生長產(chǎn)生一定抑制作用。

表3 水溶性膳食纖維濃度對雙歧桿菌生長的影響

表4 水溶性膳食纖維濃度對雙歧桿菌生長的影響

表5 水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對嗜酸乳桿菌生長影響

表6 水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對嗜酸乳桿菌生長的影響

表7 水溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)對大腸桿菌生長的影響

表8 腸道益生菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)（對數(shù)值）

圖1 混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)（對數(shù)值）

水溶性膳食纖維進入人體消化道后，由于缺少相關消化酶不能被吸收，幾乎未受影響直接進入大腸。在大腸內(nèi)，益生菌通過分泌到胞外的糖苷酶將其降解，然后再吸收利用，這樣水溶性膳食纖維可作為益生菌的碳源，選擇性地刺激益生菌的生長和活力，從而使益生菌增殖，而大腸桿菌對其不能利用或利用率很低。另一方面，水溶性膳食纖維作為益生菌發(fā)酵的底物，可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌在自身的代謝中也會產(chǎn)生乳酸等，這會使得腸道的pH值降低，腸道的酸性環(huán)境具有較強的抑菌和殺菌作用，能夠控制病原菌的生長和繁殖。乳酸菌等在腸道產(chǎn)生的有機酸及細菌素，也可抑制大腸桿菌和腐敗細菌的生長。

總之，水溶性膳食纖維促使益生菌大量增殖，形成微生態(tài)競爭優(yōu)勢，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，直接抑制了外源性和腸內(nèi)固有腐敗菌的生長繁殖，從而有益于發(fā)揮正常腸道菌在屏蔽、營養(yǎng)、免疫上的正常功能，是一種良好的益生菌增殖因子。

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