任大賓 楊志文

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600；2上海市松江區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201600

SAP是由胰腺局部炎癥所致，累及全身炎癥反應(yīng)綜合征，繼而造成多器官功能障礙綜合征的臨床危重病。“白細(xì)胞過度激活學(xué)說”是SAP發(fā)病的重要機(jī)制之一。胰腺組織自身消化釋放內(nèi)源性物質(zhì)，激活中性粒細(xì)胞，使得其凋亡延遲，繼而釋放大量炎癥因子，引發(fā)“瀑布”效應(yīng)，致使SAP患者出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征[1-2]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)僅在腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞、造血細(xì)胞中表達(dá)[3]。2008年Lepreux等[4]首次發(fā)現(xiàn)TERT在中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)。近年有研究報(bào)道，冠心病[5-6]、原發(fā)性卵巢功能不全患者[7]中性粒細(xì)胞TERT水平異常表達(dá)，中性粒細(xì)胞凋亡延遲，但迄今為止，未見SAP時(shí)中性粒細(xì)胞TERT表達(dá)水平的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探討TERE對急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)大鼠中性粒細(xì)胞凋亡的影響。

材料與方法

一、動(dòng)物與分組

24只SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號SCXK(滬)2017-0005。大鼠禁食12 h，自由飲水，按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組，ANP 3、6 h組[8]和TERT抑制劑BIBR1532干預(yù)組(BIBR1532組)，每組6只。ANP組大鼠采用胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c(1 ml/kg)造模，分別在造模后3、6 h處死，經(jīng)心臟采血。BIBR1532組大鼠在造模前腹腔注射2 mg/kg TERT抑制劑BIBR1532(美國EMC公司)，每周3次，連續(xù)2周，于造模3 h后處死，經(jīng)心臟采血。正常對照組大鼠未經(jīng)任何處理。取各組大鼠胰腺組織，置10%甲醛溶液中固定。

二、方法

1．外周血中性粒細(xì)胞分離：采集的大鼠血樣本經(jīng)1%葡聚糖沉淀紅細(xì)胞，取上層富含粒細(xì)胞的血漿，按1∶1容積加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液，以1 500 r/min離心20 min，離心半徑9 cm。通過低滲溶液溶解紅細(xì)胞，Percoll密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞，采用臺盼藍(lán)、瑞氏染色檢測中性粒細(xì)胞存活率和純度。

2．中性粒細(xì)胞TERT mRNA檢測：應(yīng)用熒光定量PCR法檢測中性粒細(xì)胞的TERT mRNA表達(dá)量。TERT正向引物序列為5′-CAGATGCGACCCCTATTC-3′，反向引物序列為5′-TGTAACCGGAGCAAACTC-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，反向引物序列為5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

3．中性粒細(xì)胞TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測TERT蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、Bax表達(dá)量?？筎ERT、Bcl-xL、Bax單克隆抗體購自英國abcam公司，工作濃度均為1∶1 000；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1∶200。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比為蛋白相對表達(dá)量。

4．中性粒細(xì)胞凋亡檢測：取含2×106/ml中性粒細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)液500 μl，均勻接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)16 h后，依次加入2.5 μl Annexin V-FITC 和5.0 μl碘化丙啶(PI)溶液，上流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞凋亡。

5．血清TNF-α、IL-6檢測：收集與分離大鼠外周血血清，ELISA檢測試劑盒 (美國eBioScience 公司)檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平，按試劑盒說明書操作。

6．胰腺組織病理學(xué)檢查：取甲醛溶液固定的胰腺組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠中性粒細(xì)胞TERT mRNA及蛋白的表達(dá)

分離后的大鼠中性粒細(xì)胞瑞氏染色顯示細(xì)胞核呈桿狀或2～5分葉狀，符合中性粒細(xì)胞特征，純度>95%(圖1A)；臺盼藍(lán)染色顯示極少量細(xì)胞呈淡藍(lán)色，中性粒細(xì)胞存活率>97%(圖1B)。

圖1 外周血中性粒細(xì)胞特征 1A 瑞氏染色(×1000)；1B 臺盼藍(lán)染色(×100)

正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細(xì)胞TERT mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.26、3.31±1.07、5.21±0.78、1.95±0.49，TERT蛋白表達(dá)量分別為0.09±0.03、0.43±0.12、0.58±0.11、0.22±0.07(圖2)，ANP 3、6 h 組TERT mRNA及蛋白表達(dá)水平高于正常對照組，而BIBR1532組低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.08、12.52、2.82，6.92、7.69、4.05；P值均<0.05)。表明TERT mRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒細(xì)胞中高表達(dá)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；TERT為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；BIBR1532為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑圖2 正常對照組(1)、ANP 3 h組(2)、ANP 6 h組(3)、BIBR1532組(4)大鼠外周血中性粒細(xì)胞TERT蛋白表達(dá)

二、各組大鼠中性粒細(xì)胞Bcl-xL、Bax蛋白的表達(dá)

正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組中性粒細(xì)胞的Bcl-xL蛋白表達(dá)量分別為0.19±0.05、0.50±0.07、0.85±0.04、0.40±0.11，Bax蛋白表達(dá)量分別為0.29±0.08、0.23±0.03、0.17±0.02、0.43±0.12(圖3)。與正常對照組比較，ANP 3、6 h組的Bcl-xL表達(dá)量上升(t值分別為7.75、16.30，P值均<0.05)，而Bax表達(dá)量下降(t值分別為4.22、6.74，P值均<0.05)；與ANP 3 h組比較，BIBR1532組Bcl-xL表達(dá)量下降(t=5.42，P<0.05)，而Bax表達(dá)量上升(t=5.59，P<0.05)。表明TERT表達(dá)量升高則抑制ANP大鼠外周血中性粒細(xì)胞凋亡。

三、各組大鼠中性粒細(xì)胞凋亡率

中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng)16 h后，正常對照組、ANP 3 h組、ANP 6 h組、BIBR1532組外周血中性粒細(xì)胞凋亡率分別為(10.03±0.74)%、(7.99±0.27)%、(6.65±0.36)%、(22.98±2.86)%。ANP 3、6 h 組中性粒細(xì)胞凋亡率低于正常對照組，而BIBR1532組高于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.52、7.27、12.63，P值均<0.05，圖4)。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；TERT為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；BIBR1532為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑圖3 正常對照組(1)、ANP 3 h組(2)、ANP 6 h組(3)、BIBR1532組(4)大鼠外周血中性粒細(xì)胞Bcl-xL、Bax蛋白表達(dá)圖4 正常對照組(4A)、ANP 3 h組(4B)、ANP 6 h組(4C)、BIBR1532組(4D)大鼠外周血中性粒細(xì)胞流式細(xì)胞分析圖

四、各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平

正常對照組、ANP 3 h組、BIBR1532組血清TNF-α水平分別為(96.67±27.12)、(382.30±46.33)、(206.88±36.42) ng/L，IL-6水平分別為(43.34±14.50)、(134.21±16.13)、(88.06±13.05)ng/L，ANP 3 h組TNF-α、IL-6水平均高于正常對照組，BIBR1532組TNF-α、IL-6水平均低于ANP 3 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為22.57、12.63,17.77、9.43；P值均<0.05)。表明TERT高表達(dá)可上調(diào)血清TNF-α、IL-6水平。

五、各組大鼠胰腺組織的病理改變

正常對照組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，無間質(zhì)充血、出血和腺泡細(xì)胞壞死。ANP組大鼠胰腺組織可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，小葉間隔增寬、結(jié)構(gòu)破壞，組織壞死。BIBR1532組大鼠胰腺組織病理改變較ANP組明顯改善(圖5)。表明TERT高表達(dá)可加重ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。

注：ANP為急性壞死性胰腺炎；BIBR1532為端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑圖5 正常對照組(5A)、ANP 3 h組(5B)、ANP 6 h組(5C)、BIBR1532組(5D)大鼠胰腺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

討 論

端粒酶為自身攜帶模板的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白3個(gè)主要的亞單位組成。端粒酶是細(xì)胞凋亡延遲的關(guān)鍵信號分子[9]，通過端粒和非端粒保護(hù)機(jī)制，維持端粒長度和改善線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表達(dá)程度反映端粒酶活性水平[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化大鼠在持續(xù)炎癥遞質(zhì)刺激下，其動(dòng)脈組織的端粒酶活性增加13倍[5]；不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血中性粒細(xì)胞端粒酶活性較健康者增加2倍，從動(dòng)脈粥樣硬化患者的硬化斑塊分離出的中性粒細(xì)胞中端粒酶活性增加更顯著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍[6]；原發(fā)性卵巢功能不全患者外周血中性粒細(xì)胞的端粒酶活性下降3倍，加速細(xì)胞衰老過程，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵泡的耗竭或功能失常[7]。

2011年von Figura等[11]報(bào)道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，顯示端粒酶參與急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ANP 大鼠外周血中性粒細(xì)胞的TERT mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡的時(shí)間延長，抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)水平上升，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平下降，同時(shí)外周血 TNF-α、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子水平也顯著升高。提示BIBR1532顯著下調(diào)中性粒細(xì)胞的TERT mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，降低外周血炎癥因子水平，有效緩解ANP大鼠胰腺組織的炎癥損傷。然而，本研究未行BIBR1532時(shí)間及劑量依賴性效應(yīng)觀察，存在一定的局限性。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明任大賓：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理；楊志文：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持