斯日古楞 郝丹丹 李天柱 烏英嘎 田慧敏 張鳳寧 白春英 瑞云

摘 要：目的：探討二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid， EPA）對(duì)高果糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠中骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）和蛋白激酶B（protein kinaze B， Akt）表達(dá)的作用。方法：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（CON）、高果糖組（HF）和高果糖+EPA組（HF+EPA）。EPA組為高果糖飼料添加6%的EPA。EPA攝入4周后，分別檢測(cè)各組大鼠空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FIns）及計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），研究EPA對(duì)胰島素敏感性的作用。采用Western Blot方法檢測(cè)骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達(dá)。結(jié)果：與CON組比較，HF組睪丸周?chē)緷裰仫@著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組睪丸周?chē)緷裰仫@著降低（P<0.05）。與CON組比較，HF組FBG、FIns、HOMA-IR均顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組FBG、FIns、HOMA-IR均顯著降低（P<0.05）。與CON組比較，HF組骨骼肌GLUT4和p-Akt表達(dá)顯著減少（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組骨骼肌GLUT4和p-Akt表達(dá)顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：EPA能夠顯著改善高果糖誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素抵抗，機(jī)制涉及EPA能上調(diào)骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達(dá)，調(diào)控胰島素信號(hào)分子蛋白表達(dá)，從而改善骨骼肌胰島素抵抗。

關(guān)鍵詞：二十碳五烯酸;胰島素抵抗;GLUT4;Akt

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2022）03-0028-03

胰島素抵抗（Insulin resistance， IR）是指機(jī)體靶器官、靶組織對(duì)生理濃度的胰島素生物效應(yīng)的反應(yīng)性下降或喪失而產(chǎn)生的病理狀態(tài)[1]。骨骼肌是利用葡萄糖和維持血糖平衡的重要組織，發(fā)生胰島素抵抗的主要部位。在骨骼肌細(xì)胞中，在胰島素的信號(hào)刺激下，骨骼肌中的葡萄糖攝取主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）的介導(dǎo)，胰島素與其受體結(jié)合，激活蛋白激酶B（protein kinaze B， Akt）分子，從而改變GLUT4的轉(zhuǎn)位和利用，促進(jìn)骨骼肌的葡萄糖攝取[2]。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是IR發(fā)生的主要機(jī)制之一。二十碳五烯酸（又稱(chēng)十二碳五烯酸，eicosapentaenoic acid，EPA）是一種n-3系列多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs），具有降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、減少血中中性脂肪值、緩和炎癥性疾病的癥狀等作用[3-5]。由胰島素抵抗的改善是n-3 PUFAs的生物效應(yīng)引起的疾病預(yù)防主要機(jī)制之一。目前未報(bào)到EPA攝入對(duì)高果糖誘導(dǎo)大鼠骨骼肌胰島素抵抗的作用。本研究選擇胰島素抵抗大鼠，觀(guān)察EPA對(duì)其骨骼肌組織中GLUT4和p-Akt表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠24只（雄性，體重220～230g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將大鼠在恒溫（23±2℃）的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，明暗交替時(shí)間12h/12h。

1.1.2 主要試劑

二十碳五烯酸（純度98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;D-果糖購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;胰島素放射免疫試劑盒購(gòu)自上海滬峰生物科技有限公司;GLUT4抗體、Akt抗體購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制造

適應(yīng)飼養(yǎng)1周，將大鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組（CON）、高果糖組（HF）和高果糖+EPA組（HF+EPA），每組8只。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，HF組給予高果糖飼料喂養(yǎng)，HF+EPA組給予高果糖飼料添加6%的EPA喂養(yǎng)。每周稱(chēng)體重1次。4周高果糖飼料喂養(yǎng)建立胰島素抵抗模型[6]。

1.2.2 標(biāo)本采集

EPA攝入4周后，將各組大鼠放入代謝籠禁食、禁水12h，尾靜脈取血待測(cè);腹主動(dòng)脈取血，以3000r/min離心20min，分離血清，-20℃保存待測(cè)。斷頸處死大鼠，解剖取骨骼肌樣本，-80℃凍存待測(cè);同時(shí)取睪丸周?chē)窘M織，測(cè)量濕重。

1.2.3 測(cè)定空腹血糖、血清胰島素

EPA攝入4周后，將各組大鼠放入代謝籠禁食、禁水12h，血清標(biāo)本采集，次日采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖（FBG）、放免法測(cè)定血液中胰島素（FIns）的濃度。具體按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4 計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)

使用穩(wěn)態(tài)模型（HOMA）評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）[7]。HOMA-IR模型公式為HOMA-IR =FBG（mg/dl）×FIns（ng/ml）/22.5。

1.2.5 檢測(cè)GLUT4和p-Akt表達(dá)

采用Western blot檢測(cè)GLUT4、Akt1/2和p-Akt，方法進(jìn)行[8]。使用SDS-PAGE分離了10μg來(lái)自肌肉的蛋白質(zhì)提取物，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉鹽緩沖液（TBS）封閉1h后，將膜與1：1000稀釋的一抗在4°C振蕩孵育過(guò)夜。然后TBS-T洗三次，并與1：1000加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記相應(yīng)的二抗在室溫下震蕩孵育1h，TBS洗三次。使用ECL試劑盒進(jìn)行熒光顯示反應(yīng)。暗室中曝光，顯影，使用Image-J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較單因素方差分析，P<0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、睪丸脂肪組織濕重比較

EPA攝入4周后，各組之間體重?zé)o明顯差異（P>0.05）。與CON組比較，HF組睪丸周?chē)窘M織濕重顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組睪丸周?chē)窘M織濕重顯著降低（P<0.05），如表1所示。

2.2 各組大鼠空腹血糖（FBG）、胰島素（FIns）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的比較

EPA攝入4周后，與CON組比較，HF組FBG、FIns均顯著增加（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組FBG、FIns均顯著減少（P<0.05）。與CON組比較，HF組HOMA-IR顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組HOMA-IR顯著降低（P<0.05），如表2所示。

2.3 各組大鼠GLUT4和p-Akt表達(dá)的比較

EPA攝入4周后，各組之間Akt1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。與CON組比較，HF組骨骼肌組織中GLUT4、p-Akt的表達(dá)量顯著減少（P<0.05）。與HF組比較，HF+EPA組骨骼肌組織中GLUT4、p-Akt的表達(dá)量顯著增加（P<0.05），如表3和圖1所示。

3 討論

目前，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活方式的改變，尤其是果糖大量攝入導(dǎo)致肥胖、2型糖尿病等疾病已成為全球人們的健康問(wèn)題。這些疾病的最主要病理生理機(jī)制是胰島素抵抗（IR）。如果機(jī)體胰島素分泌障礙，胰島素信號(hào)通路異常，會(huì)導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用降低，誘導(dǎo)IR的發(fā)生[9]。胰島素的主要信號(hào)通路是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明，IR使胰島素刺激引起的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生障礙，骨骼肌對(duì)血糖的吸收減弱[10]。GLUT4能在胰島素刺激下使骨骼肌攝取葡萄糖。PI3K激活A(yù)kt后，通過(guò)GLUT4分子促進(jìn)葡萄糖的利用，從而發(fā)揮胰島素代謝調(diào)節(jié)作用。在胰島素和運(yùn)動(dòng)的刺激下，GLUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上，膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中起到作用[11，12]。因此，GLUT4和p-Akt表達(dá)是改善IR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

近期研究發(fā)現(xiàn)，高果糖誘導(dǎo)的動(dòng)物模型中n-3 PUFAs防止高果糖引起的胰島素敏感組織的脂肪酸譜變化，從而改善IR[13]。糖尿病模型中，n-3 PUFAs之一的EPA可改變胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使骨骼肌中GLUT4的表達(dá)增加[14]。但EPA對(duì)高果糖引起的IR大鼠骨骼肌中GLUT4和p-Akt的作用仍未報(bào)道。本研究用高果糖喂養(yǎng)的大鼠建立胰島素抵抗模型，并進(jìn)行EPA攝入方式。研究結(jié)果表明，各組大鼠體重?zé)o顯著差異，但HF組睪丸周?chē)緷裰亍GB、FIns、HOMA-IR均升高，表明高果糖誘導(dǎo)的IR模型建立成功;EPA攝入后，睪丸周?chē)緷裰?、FGB、FIns、HOMA-IR均降低。這些結(jié)果表明EPA能改善高果糖誘導(dǎo)的IR。Western Blot結(jié)果顯示，HF組中骨骼肌GLUT4表達(dá)水平減少，表明高果糖攝入使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用下降;EPA攝入后，骨骼肌GLUT4表達(dá)水平顯著增加，表明EPA明顯改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。為了進(jìn)一步觀(guān)察EPA改善IR大鼠骨骼肌GLUT4的表達(dá)，是否與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)。檢測(cè)胰島素信號(hào)中的分子p-Akt的表達(dá)水平。與GLUT4的結(jié)果一致，IR大鼠EPA攝入后骨骼肌p-Akt明顯上調(diào)。提示EPA可上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路，通過(guò)GLUT4分子促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，改善胰島素抵抗。

綜上所述，高果糖誘導(dǎo)的大鼠產(chǎn)生IR，并存在骨骼肌組織胰島素信號(hào)通路異常。EPA可能上調(diào)骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達(dá)，調(diào)控胰島素信號(hào)分子蛋白表達(dá)，從而改善骨骼肌胰島素抵抗。

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