◎ 邱慧珍，黃鳳妹，何孝金

（南平市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 南平 353000）

五氯酚也稱五氯苯酚（PCP），是一種重要的防腐劑，能阻止真菌的生長(zhǎng)、抑制細(xì)菌的腐蝕作用，長(zhǎng)期以來均被用作皮革品和木材的防霉劑，對(duì)防治霉菌與一般蟲類（如白蟻）均有效果。五氯酚酸鈉鹽（PCP-Na），用于消滅血吸蟲中間宿主釘螺和防治稗草等，由于其具有較高水溶性，溶于水?dāng)U散后對(duì)水源土壤造成污染，可通過食物蓄積于動(dòng)物體內(nèi)，殘留在食品中[1]。

五氯酚降解緩慢，有致癌、致畸、致突變?nèi)路磻?yīng)，長(zhǎng)期食用五氯酚污染的食品可能對(duì)肝、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害[2]。為規(guī)范養(yǎng)殖用藥行為，保障動(dòng)物源性食品安全，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)將五氯酚列為禁用藥物。目前文獻(xiàn)報(bào)道五氯酚的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[3]。國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2021年版）中五氯酚的檢驗(yàn)依據(jù)為GB 23200.92—2016，其原理為五氯酚殘留用堿性乙腈水溶液提取，經(jīng)MAX固相萃取柱凈化，濃縮、定容后，用液相色譜-質(zhì)譜儀檢測(cè)和確證，外標(biāo)法定量。本文探討GB 23200.92—2016中動(dòng)物源食品中五氯酚殘留量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)解讀及方法優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

TSQ Quantis熱電液相質(zhì)譜儀；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)密理博）；冷凍離心機(jī)（德國(guó)sigma）；均質(zhì)器（德國(guó)IKA）；固相萃取裝置。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑

五氯酚（廠家：壇墨質(zhì)檢；標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：91412IA；批號(hào)：902010；濃度200 μg·mL-1）、甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2.2 材料

Copure（逗點(diǎn)生物）MAX凈化小柱（貨號(hào)：COMAX360，批號(hào)：MO030447）。

1.3 色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A：0.05%甲酸；B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1.0 min，40%→75% B；1.0～7.5 min，75% →95% B；7.5～ 8.0 min，95% → 40% B；8.0～10.0 min，40% B；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）；五氯酚多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見表1。

表1 五氯酚多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件表

1.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

將五氯酚液標(biāo)（200 μg·mL-1）配成 20 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液，冷凍保存6個(gè)月；再將其用50%甲醇水溶液按逐級(jí)稀釋為 1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、8 ng·mL-1和10 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作使用液。

1.6 樣品溶液的制備

稱取均質(zhì)試樣2 g（精確到0.01 g），置于50 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水（70%）溶液。均質(zhì)提取2 min；超聲提取5 min后于6 000 r·min-1離心5 min，收集上清液于刻度離心管中。殘?jiān)貜?fù)上述提取步驟1次，合并上清液，混勻。凈化：提取溶液轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的MAX固相萃取柱（使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化）中，以約1滴/s流速使樣品溶液全部通過固相萃取柱，棄去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗，淋洗液完全通過小柱后，棄去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱5 min以上。以4 mL 8%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液用試管收集，40 ℃水浴下吹氮濃縮近干，50%甲醇水定容至2 mL，混勻。過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.7 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取5份與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品2.0 g，分別加入20 ng·mL-1五氯酚標(biāo)液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.0 mL，按照1.6項(xiàng)下處理，最終得到1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、8 ng·mL-1和 10 ng·mL-1相應(yīng)基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作使用液。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相方法優(yōu)化與典型圖譜

GB 23200.92—2016的流動(dòng)相：甲醇 +5 mmol·L-1乙酸銨溶液，梯度洗脫見表2。在該流動(dòng)相梯度下五氯酚于3.98 min出峰，因流動(dòng)相中的甲醇在梯度變化時(shí)造成基線波動(dòng)較大，考慮用乙腈代替甲醇，基線波動(dòng)雖有減少，但雞肉基質(zhì)加標(biāo)后目標(biāo)峰附近有干擾峰，如圖1所示，影響定量的準(zhǔn)確性[4]。

表2 GB 23200.92—2016流動(dòng)相梯度表

圖1 甲醇+5 mmol·L-1乙酸銨溶液的雞肉樣品圖譜圖

考慮用0.05%甲酸水代替5 mmol·L-1乙酸銨溶液[4]，五氯酚出峰時(shí)間為6.55 min，雞肉基質(zhì)加標(biāo)后，目標(biāo)峰與干擾峰明顯分離，如圖2所示，優(yōu)化后流動(dòng)相組成為0.05%甲酸水+乙腈，梯度洗脫程序見1.3項(xiàng)。

圖2 0.05%甲酸+乙腈的雞肉樣品圖譜圖

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇與優(yōu)化

五氯酚含有酚羥基，為有機(jī)酸類，因此采用負(fù)離子模式掃描（ESI-）。五氯酚為共軛結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，較難被打碎，主要的二級(jí)碎片均為氯離子，不易找到特征離子[3,5]。GB 23200.92—2016方法中質(zhì)譜MRM掃描采用“母離子找母離子模式”不易受到樣品基質(zhì)干擾[6]。五氯酚結(jié)構(gòu)中含有5個(gè)Cl原子，Cl原子存在35Cl和37Cl兩種同位素，兩種同位素組成一系列m/z質(zhì)譜峰，即：262.7、264.7、266.7、268.7[6,7]。

2.3 固相萃取小柱的選擇和分步收集

在SPE操作過程中，分步收集較為常用，分步收集是將收集的上樣液、淋洗液、洗脫液進(jìn)行二次洗脫，并上機(jī)分析，從而判斷目標(biāo)化合物具體損失的環(huán)節(jié)，明確試驗(yàn)步驟中具體需要優(yōu)化的環(huán)節(jié)。綜上所述，，參照GB 23200.92—2016分別收集上樣液、淋洗液、4%甲酸甲醇洗脫液、8%甲酸甲醇洗脫液，進(jìn)行試驗(yàn)，得出試驗(yàn)數(shù)據(jù)，見表3。

表3 MAX固相萃取小柱的分布收集回收率表

五氯酚屬于酸性化合物，其pKa接近5，在酸性條件下呈分子狀態(tài)，更易溶于有機(jī)溶劑，在堿性條件下呈離子態(tài)，更易溶于水[7]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.92—2016中采用5%三乙胺的乙腈-水（70%）溶液提?。辉撎崛∫褐泻兴?，導(dǎo)致提取液中干擾物較多，即使低溫條件下高速離心后有些樣品也有些渾濁，故需凈化處理。

MAX小柱原理：堿性條件下五氯酚離子化，被小柱吸附；酸性洗脫下五氯酚變回中性分子，失去與小柱間的作用力，從而被洗脫出來。不同品牌的MAX柱對(duì)五氯酚的保留能力不同，如果更換了不同品牌的MAX柱須對(duì)其做不同酸度的洗脫試驗(yàn)。從表3可以看出：將4%甲酸甲醇洗脫改成8%甲酸甲醇洗脫，可以將五氯酚目標(biāo)物從MAX柱上洗脫下來，回收率從0%提高到80%以上。

2.4 溶劑效應(yīng)和基質(zhì)效應(yīng)考查

GB 23200.92—2016標(biāo)準(zhǔn)采用的是空白樣品基質(zhì)匹配來配制工作曲線，本文考察了豬肉、雞肉、淡水魚、牛奶、豬肝等動(dòng)物源性組織樣品的基質(zhì)效應(yīng)情況，根據(jù)文獻(xiàn)介紹，基質(zhì)效應(yīng)ME=K1/K2，K1為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，K2為標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率，如果ME為0.8～1.2，則基質(zhì)效應(yīng)不顯著；如果ME大于1.2，五氯酚信號(hào)響應(yīng)在該樣品基質(zhì)為具有顯著增強(qiáng)；如果ME小于1.2，五氯酚信號(hào)響應(yīng)在該樣品基質(zhì)為具有顯著減弱[2,7]。分別以各類不同樣品基質(zhì)陰性樣品提取液為基質(zhì)溶液作溶劑，以相應(yīng)的基質(zhì)提取溶液不同濃度為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體結(jié)果見表4。

表4 樣品基質(zhì)工作曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及基質(zhì)效應(yīng)ME表

除牛奶基質(zhì)外，雞肉、魚肉、豬肝基質(zhì)效應(yīng)不顯著，這也說明了采用Copure的MAX凈化小柱有較好的凈化效果，可以采用溶劑（50%甲醇水溶液）來繪制工作曲線。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的回收率、精密度

分別取陰性空白雞肉、豬肝樣品2.0 g加入五氯 酚 標(biāo) 液（20 ng·mL-1）100 μL、200 μL、400 μL，即添加水平為 1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行制備6份樣品。按照1.6項(xiàng)下處理，理論上機(jī)濃度相應(yīng)為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1。雞肉基質(zhì)中 3 個(gè)濃度的加標(biāo)平均回收率為93.6%～104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.3%～9.9%；豬肝基質(zhì)中3個(gè)濃度的加標(biāo)水平平均回收率為84.5%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.5%～6.6%，見表5。

表5 樣品加標(biāo)回收率與方法精密度的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表（n=6）

2.5.2 方法的定量限

分別取空白基質(zhì)雞肉、豬肝樣品2.0 g，加標(biāo)水平為 1.0 μg·kg-1（取 20 ng·mL-1五氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 100 μL），按1.6項(xiàng)樣品前處理，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測(cè)定信噪比。GB 23200.92—2016方法定量限為1.0 μg·kg-1，按本方法測(cè)定的S/N≥10，試驗(yàn)結(jié)果見表6，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表6 定量限試驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）測(cè)定動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的方法，樣品經(jīng)過5%三乙胺的乙腈-水（70%）溶液提取，經(jīng)MAX固相萃取柱凈化，8%甲酸甲醇溶液洗脫，50%甲醇水定容，雞肉、豬肝樣品基質(zhì)分別做3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率在84.5%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10%（n=6）。該方法操作簡(jiǎn)單、回收率高、重現(xiàn)性好，可用于動(dòng)物源性食品中五氯酚殘留量的日常檢測(cè)。