◎ 萬 欣，盧宗梅，周 勇，陳 影，劉利利，葉 震，何 珣，陳可泉

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

在過去的幾十年里，益生菌在動物營養(yǎng)和人類健康領(lǐng)域的應(yīng)用已展現(xiàn)優(yōu)勢，如替代化學(xué)合成抗生素、降低血清膽固醇、增強生物機體免疫功能、治療腸道疾病等[1-3]。益生菌能夠發(fā)揮益生功能的前提是它們必須在環(huán)境條件下有效儲存和在胃腸道（GIT）條件存活下來。因此，為了使益生菌能有效保存和提高其在通過胃腸道過程時的生存能力，將益生菌封裝到不易消化的食材中已被證明是非常重要且有效的。封裝涉及將益生菌細胞固定在聚合物基質(zhì)中，該基質(zhì)能夠在環(huán)境條件和胃中保留其結(jié)構(gòu)，然后在腸道遠端降解和溶解[4-5]。在目前被研究和使用的不同類型封裝材料中，β-葡聚糖是一種獨特的多糖，可以有效地被用作密封劑和熱保護劑。β-葡聚糖的獨特之處在于其固有的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，這是其他多糖所沒有的，這也使益生菌細胞容易被包裹在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。

β-葡聚糖是一種無支鏈多糖，由β-D-吡喃葡萄糖單元通過1,3-、1,4-和1,6-糖苷鍵連接[6-8]。β-葡聚糖具有益生元性質(zhì)，能對動物和人類健康產(chǎn)生有益影響。β-葡聚糖作為益生元已被廣泛研究。但是，到目前為止，還沒有研究使用β-葡聚糖作為益生菌細胞的包封劑?？紤]到這些因素，本研究旨在利用β-葡聚糖作為一種新型壁材料，用于封裝益生菌細胞和評估其耐受熱、低pH值和胃腸道壓力的能力以及封裝細胞在環(huán)境條件下的儲存穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，來源于中糧生物科技股份有限公司。研究中使用的所有化學(xué)品均為分析級。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在無菌MRS培養(yǎng)基（上海吉至生化科技有限公司，中國）中生長12 h。胰酶（Sigma-Aldrich公司，美國）。

JSM-5900掃描電子顯微鏡（JEOL公司，日本）。

1.2 封裝

通過將3 g/100 mL β-葡聚糖和1 mLLactobacillus plantarumCGMCC 15013培養(yǎng)液充分混合來制備漿液；向該混合物中加入0.02 mL/100 mL吐溫80；之后將混合物劇烈攪拌10 min直至其乳化并呈現(xiàn)乳脂狀；然后向該混合物中加入33 mL PEG（聚乙二醇）并進行分離（30 min）；用含有5 mL/100 mL甘油的0.9 g/100 mL鹽水洗滌，冷凍干燥并分別在4 ℃和25 ℃下儲存。

1.3 掃描電子顯微鏡

將樣品放置在附著于圓形鋁制樣品樁的膠帶上。用金-鈀垂直涂覆后，使用JSM-5900掃描電子顯微鏡在5 kV的加速器電位下對樣品拍照。

1.4 封裝率和儲存穩(wěn)定性

將1 g膠囊化微珠重新懸浮在9 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1，pH=7.0）中，然后均質(zhì)化 15 min。菌落形成單位（CFU·g-1）通過將培養(yǎng)物稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布在瓊脂平板上，并在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h來確定。使用方程（1）計算微囊化過程中的封裝率（EY）（%）：

式中：N是微膠囊中的活細胞數(shù)（logCFU·g-1），N0是制備過程中添加的活細胞的初始數(shù)量（logCFU·g-1）。

為了確定封裝益生菌細胞的儲存穩(wěn)定性，在4 ℃和和25 ℃下，每15天間隔計算活菌數(shù)，持續(xù)2個月。

1.5 在模擬胃液（SGJ）中存活

新鮮模擬胃液是通過將3 g·L-1胃蛋白酶懸浮在無菌生理鹽水（9 g·L-1）中制備，并用 1.0 mol·L-1HCl將pH調(diào)節(jié)至3.0。將0.2 g膠囊化微珠（4 ℃儲存）和游離細胞分別懸浮在10 mL模擬胃液中，并在37 ℃下以50 r·min-1的速度持續(xù)攪拌5 min、30 min、60 min和120 min。SGJ中的活菌計數(shù)確定為logCFU·g-1。

1.6 在模擬腸液（SIJ）中存活

取0.2 g膠囊化微珠和游離細胞，分別懸浮在模擬腸液中。腸液中含有1 mg·mL-1胰酶和7 mL新鮮雞膽，用0.1 mol·L-1NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至8.0。懸浮液在37 ℃下孵育6 h，SIJ中的活菌計數(shù)確定為logCFU·g-1。

1.7 游離和微囊化細胞在冷凍和熱處理下的活菌數(shù)

將1 g微膠囊和1 mL游離細胞懸液轉(zhuǎn)移到各含有10 mL無菌蒸餾水的試管中，并在不同溫度（-75 ℃、55 ℃、65 ℃和75 ℃）處理樣品1 min和10 min。

1.8 統(tǒng)計分析

使用商業(yè)統(tǒng)計軟件包STATISTICA（StatSoft）計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、方差分析（ANOVA）。然后在5%的顯著性水平上使用Duncan的多重范圍檢驗對這些數(shù)據(jù)進行比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡用于觀察和研究干燥微膠囊的表面形態(tài)。β-葡聚糖具有粗糙表面和較大孔徑的蜂窩。有文獻報道了β-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)為類似螺旋纏繞結(jié)構(gòu)[9]，其致密、無裂紋的表面特征與內(nèi)部蜂窩狀結(jié)構(gòu)一起，可使β-葡聚糖能夠更好地承受機械應(yīng)力并保護所含成分免受惡劣環(huán)境（例如氧化、光照、低或高pH值）的影響。含有Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌株的SEM照片顯示，細菌細胞可以被包裹在β-葡聚糖中（圖1b）。利用乳化法包囊在含有藻酸鹽的植物乳桿菌CM53微膠囊中也報道了類似的分布模式[10]。

圖1 β-葡聚糖封裝Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的SEM圖

2.2 封裝率和儲存穩(wěn)定性

封裝的目的是保護封裝的益生菌細胞免受有害環(huán)境條件的影響，例如熱應(yīng)激、胃腸應(yīng)激和滲透應(yīng)激等，并提高細胞在儲存過程中的穩(wěn)定性[11]。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的初始活菌計數(shù)（logCFU·g-1）和封裝率（%）分別為9.54和75.33%（p＞0.05）。乳化過程在室溫下進行，有助于獲得良好的封裝率。使用乳化法進行封裝時，與來自甜菜、菊苣和燕麥的β-葡聚糖的封裝率相似[12]。在4 ℃和25 ℃下，間隔15天、持續(xù)2個月的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的生存能力顯示在圖2在4 ℃貯存60天后，包裹在β-葡聚糖中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至3.23 logCFU·g-1；而在25 ℃貯存60天后Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至1.11 logCFU·g-1（圖2）。

圖2 封裝Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的儲存穩(wěn)定性圖

然而，游離Lactobacillus plantarumCGMCC在4 ℃和25 ℃下儲存60 天后的存活量都幾乎可以忽略不計。結(jié)果表明，與游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，封裝Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活力損失最小。儲存后游離乳酸菌活力降低可能是由于環(huán)境壓力造成的。然而，封裝可以保護細胞免受這些不利環(huán)境條件的影響[13]。益生菌的特征之一是它作為配方產(chǎn)品應(yīng)具有耐受儲存期的能力。特殊類型的涂層材料用于增強微生物的這種特性，這是將益生菌封裝在β-葡聚糖基質(zhì)中的首次報告。β-葡聚糖已被報道為一種潛在的益生元，將益生菌摻入這樣的包衣材料中，既可作為益生元又可作為包封材料，通過促進乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益微生物群落的生長，證明對胃腸道有益并在產(chǎn)品制造過程中保護益生菌[14]。

2.3 在模擬胃液（SGJ）中存活

將游離和封裝的益生菌暴露于模擬胃液中，然后進行比較。如表1所示，與游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，β-葡聚糖封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在高酸性胃條件下能夠顯著保持活力（p＜0.05）。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 活 菌 數(shù) 為 9.54 logCFU·g-1， 但 在 暴 露于模擬胃液60 min后，游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 的 存 活 量 降 低 至 1.01 logCFU·g-1；在暴露于模擬胃液120 min后沒有觀察到活菌。將包裹的細胞暴露于模擬胃液120 min后，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活細胞數(shù)為 1.23 logCFU·g-1。這些結(jié)果表明，β-葡聚糖在模擬胃液消化過程中為乳桿菌提供了有效保護，這可能是由于β-葡聚糖在低pH值范圍內(nèi)的穩(wěn)定性以及人體胃腸道區(qū)域中不存在β-葡聚糖水解酶。

表1 β-葡聚糖包裹細胞在模擬胃液中的存活能力表

2.4 在模擬腸液（SIJ）中存活

模擬腸液對游離和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活力的影響見表2。結(jié)果顯示，β-葡聚糖包裹的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在模擬腸道條件下的存活數(shù)量明顯高于游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013（p＜ 0.05）。暴露于模擬腸液6 h后，封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 數(shù) 從9.54 logCFU·g-1降 低 至5.28 logCFU·g-1。暴露于膽鹽溶液6 h后，游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013未觀察到活菌。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活數(shù)減少可能是由于細胞壁被破壞[15]。β-葡聚糖通過阻止被包裹的細胞與膽汁鹽相互作用來提供對細胞壁破壞的抵抗力[7]。以低聚果糖（FOS）作為壁材的微囊化植物乳桿菌也觀察到了類似的結(jié)果[4]。

表2 β-葡聚糖包裹細胞在模擬腸液中的存活能力表

2.5 冷凍和熱處理下的存活

分別暴露于-75 ℃、55 ℃和75 ℃下10 min后，游離和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活情況如表3所示。游離活細胞數(shù)和微囊化后活細胞數(shù)之間差異顯著（p＜0.05）。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013細胞對冷凍和熱處理都非常敏感。在-75 ℃冷凍條件下，游離活細胞數(shù)量從9.54 logCFU·g-1減少到 5.11 logCFU·g-1；在 55 ℃下加熱10 min后，游離活細胞數(shù)量減少至3.57 logCFU·g-1；75 ℃下加熱10 min后，游離細胞無存活，這可能是因為細菌細胞的核酸和蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)因加熱變性，而最終導(dǎo)致細胞死亡[8]。

表3 β-葡聚糖包裹細胞在冷凍和高溫處理下的存活能力表（活菌計數(shù)單位：logCFU·g-1）

封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013細胞在55 ℃下存活良好。與游離細胞相比，被包裹的細胞對熱的敏感性較低。封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)僅從 9.54 logCFU·g-1減少至7.15 logCFU·g-1。

當(dāng)溫度從55 ℃增加到75 ℃，并在此溫度條件下暴露10 min后，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)為1.22 logCFU·g-1。β-葡聚糖可以作為微生物細胞抵御嚴(yán)酷外部條件的物理屏障，一定程度上增加被封裝細胞的活力[6-8]。同為多糖材料的金合歡樹膠已被證明可以在熱應(yīng)激期間為副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiNFBC 338提供良好的保護作用。

3 結(jié)論

目前的工作已經(jīng)證明了β-葡聚糖可以作為封裝益生菌的潛在壁材，以提高的益生菌的生存能力。包裹在β-葡聚糖基質(zhì)中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013對冷凍、熱處理、模擬胃腸道條件和儲存的耐受性有所提高。通過SEM圖片可以清楚地看出β-葡聚糖能夠?qū)actobacillus plantarumCGMCC 15013進行有效包裹。因此，β-葡聚糖封裝益生菌可以提供一種功能性微生物菌劑長期保存的方法。