鄧欣彤， 胡婕妤， 劉玲麗， 朱韻琪， 周雨蝶， 陳焱婷， 王 欣， 白雪蓮

（ 杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院， 浙江 杭州 311121）

酶（ Enzyme） 是活細胞產生的蛋白質或RNA，對其底物具有很高的特異性和催化效率。 酶是一種生物催化劑， 能使細胞內復雜的物質代謝過程有序進行， 使物質代謝適應正常的生理功能， 主導著生物的新陳代謝、 營養(yǎng)和能量轉換等許多催化過程，與生命活動密切相關的反應大多是酶催化的反應。若由于一些原因造成酶的活性減弱， 均可導致該酶催化的反應異常， 使物質代謝紊亂， 細胞結構遭到破壞， 甚至細胞死亡。 主要對細胞壁、 細胞膜、 體內代謝、 遺傳物質轉錄4 個過程中的部分酶類進行了概述， 探究酶在抑菌作用中受到的影響。

1 細胞壁相關酶類

真菌的生存有賴于細胞壁， 如稻瘟病菌的生長發(fā)育、 極性分生孢子的萌發(fā)、 芽管的定向生長和感染菌絲的生長， 這些都涉及到細胞壁的動態(tài)變化[1-2]。冒慧穎等人[3]研究表明， 幾丁質酶基因參與尖孢鐮刀菌的致病過程可影響病原菌致病力。 幾丁質和葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分， 幾丁質酶和葡聚糖酶可以降解致病菌細胞壁的幾丁質和葡聚糖成分， 導致致病菌菌絲的分解[4-5]。 李明等人[6]根據(jù)其研究結果推測檸檬醛抑制稻瘟病菌的殺菌作用與幾丁質酶密切相關， 可作為靶標酶進行殺菌作用的研究。 某些化合物可以激活β-1,3 葡聚糖酶、 幾丁質酶的活性來阻止病原菌細胞壁的合成， 從而引起激活物對病原菌的防御反應或引起病原菌自噬， 最終達到病害防治的效果[7-8]。

1.1 幾丁質酶

1.1.1 幾丁質（降解） 酶

幾丁質酶（Chitinase） 是稻瘟病菌細胞壁降解的關鍵酶， 能催化幾丁質水解生成N- 乙酰氨基葡萄糖[9-10]。 幾丁質酶可通過降解病原體內的幾丁質， 破壞其細胞結構， 干擾新陳代謝， 從而達到抑菌的目的。 劉雪等人[11]研究表明， 經苯丙烯菌酮處理后的稻瘟病菌， 其幾丁質酶活性增加， 可破壞稻瘟病菌細胞壁結構， 起到抑菌作用。 Li R Y 等人[12]研究表明，檸檬醛可以提高幾丁質酶活性， 從而破壞稻瘟病菌細胞壁的完整性， 達到抗菌目的。 李珊等人[13]研究發(fā)現(xiàn)， 比基尼鏈霉菌HD-087 產生的脂肽可以誘導稻瘟病菌菌絲體β-1,3 葡聚糖酶和幾丁質酶活性增加、幾丁質基因和β-1,3 葡聚糖基因表達上調， 導致幾丁質酶和β-1,3 葡聚糖酶快速積累， 導致病菌細胞壁被破壞。

1.1.2 幾丁質合成酶（CHS）

幾丁質是真菌細胞壁的重要成分， CHS 是幾丁質生物合成中的關鍵酶。 幾丁質的合成受到干擾或沉積， 會導致細胞壁的缺失破損， 對真菌生長繁殖造成影響。 CHS 是N- 乙酰葡糖胺（ UDP-GlcNAc）催化合成幾丁質的必要酶， 在幾丁質的合成中起決定性作用。 代猛等人[14]研究發(fā)現(xiàn)， CHS 不僅在維持細胞生長方面起著重要作用， 而且與其致病能力密切相關， 在真菌原生質體的再生方面起著非常重要的作用。 Yutani M 等人[15]研究發(fā)現(xiàn)反式茴香腦能通過抑制CHS 的活性起到抗真菌作用。 葉文雨等人[16]研究發(fā)現(xiàn)不同的幾丁質合成酶基因在不同RhoGAP 基因突變體中的表達量不同， 總體趨勢是上調的， 說明RhoGAP 基因家族蛋白可以通過調控幾丁質合酶的表達水平來參與稻瘟病菌不同階段細胞壁的合成。

1.2 β-1,3 葡聚糖酶

1.2.1 β- 1,3 葡聚糖（降解） 酶

β-1,3 葡聚糖酶（ β-1,3-GA） 是一類能水解以β-1,3 葡萄糖苷鍵連接的葡聚糖酶系， 是真菌細胞壁的主要成分之一， 可直接水解真菌菌絲上的葡聚糖，從而抑制菌絲的生長。 β-1,3 葡聚糖酶與幾丁質酶都對真菌細胞壁正常發(fā)育具有重要影響， 二者通常成對研究比較。 朱華珺等人[17]研究表明， 枯草芽孢桿菌分泌的β-1,3 葡聚糖酶能抑制稻瘟病菌的生長。 陳剛等人[18]研究表明球毛殼菌可產生β-1,3 葡聚糖酶對稻瘟病菌生長抑制作用明顯。

1.2.2 β- 1,3 葡聚糖合成酶

β-1,3 葡聚糖是由β-1,3 葡聚糖合成酶催化的，該合成酶主要由催化亞基Fks 和調節(jié)亞基Rho1 組成， 但也可能涉及其他蛋白質[19]。 β-1,3 葡聚糖合成酶抑制劑是一類新型抗真菌抗生素， 通過抑制葡聚糖合成酶干擾細胞壁的合成， 產生抗真菌作用。Armstrong-jamed D P 等人[20]研究表明， 在粗糙脈胞菌中， 具有抗菌特性的殼聚糖可以顯著降低導致β-1,3葡聚糖合成（fks） 與延伸（gel-1） 相關基因的表達。

1.3 N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGase）

N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶廣泛存在于微生物中，可以協(xié)同內切、 外切幾丁質酶將幾丁質分解為N- 乙酰氨基葡萄糖， 其在參與自然界氮循環(huán)中的作用非常重要。 在微生物體內， NAGase 同時還具有促進生物體自溶、 形態(tài)改變和營養(yǎng)代謝的作用[21]。 楊萍等人[22]研究發(fā)現(xiàn)， 立枯絲核菌細胞壁水解物可以誘導棘孢木霉N- 乙酰氨基葡萄糖苷酶活性顯著增加， 對立枯絲核菌具有較強的抑制作用。

1.4 纖維素酶（Cx）

病原菌細胞壁中含有少量纖維素， 纖維素酶是水解纖維素成小分子物質的酶， 是一種包含多組分的復合酶， 各組分協(xié)同作用降解細胞壁。 楊萍等人[22]研究表明， 棘孢木霉通過分泌纖維素酶水解細胞壁中的纖維素來破壞病原菌的細胞壁。 王桂清等人[23]研究表明， 遼細辛精油對灰葡萄孢菌的纖維素酶具有抑制作用， 酶活抑制率與精油濃度呈正比， 說明對Cx 酶的抑制作用可能是遼細辛精油對灰葡萄孢菌的抑菌機制之一。

2 細胞膜合成酶類

2.1 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶（IPC 合成酶）

鞘類磷脂是真菌細胞膜的重要組成部分， 肌醇磷酰鞘氨醇合成酶是真菌鞘類磷脂的生物合成的關鍵酶[24]。 鞘類磷脂生物合成途徑中的IPC 合成酶是真菌所特有的， 已被證明是藥物作用的理想靶標。 Tan H W 等人[25]研究表明aureobasidin 對IPC 合成酶起抑制作用， 阻止真菌鞘類磷脂生物合成。

2.2 α-1,4 去甲基化酶

麥角固醇（ 又稱麥角甾醇） 作為真菌細胞膜的重要組成成分， α-1,4 去甲基化酶是細胞膜麥角固醇合成途徑中的關鍵酶之一。 缺乏麥角甾醇會導致細胞膜結構和功能的喪失。 大多數(shù)常用的抗真菌藥物都是針對麥角甾醇生物合成中必需的關鍵酶設計的抑制劑， 其通過競爭性地與關鍵酶結合， 抑制麥角甾醇合成， 使真菌的細胞膜受到破壞， 從而抑制真菌的生長繁殖。 Gamarra S 等人[26]研究發(fā)現(xiàn)， 唑類藥物可抑制α-1,4 去甲基化酶， 阻止麥角甾醇生物合成， 對真菌細胞膜造成損傷， 增加膜通透性， 產生抗真菌作用。 甾醇合成抑制劑的主要作用機制是抑制甾醇合成過程中關鍵酶的活性， 如三唑酮主要的靶點為甾醇14-α 去甲基化酶CYP51， 通過抑制CYP51 酶的活性使甾醇合成前體的14-α 位不能正常去甲基化而抑制甾醇的有效合成， 進而破壞細胞膜的結構[27-28]。

3 參與體內代謝的酶類

3.1 合成代謝酶

過氧化物酶（ POD） 廣泛存在于動植物及微生物中， 不僅能消除自由基， 幫助調節(jié)細胞內的氧量，還能與過氧化氫酶協(xié)同解毒細胞內的有毒物質， 防止水稻受到活性氧的侵害。 過氧化物酶的活性受到抑制， 使菌絲膜系統(tǒng)和菌體蛋白質對內外環(huán)境更敏感， 從而影響微生物代謝。 林志偉等人[29]研究表明，黃綠木霉菌發(fā)酵液在一定程度上可以使稻瘟病菌POD酶活性下降， 對于稻瘟病菌的呼吸影響十分顯著。

谷氨酰胺合成酶（GS） 是一種參與生物體氮代謝和碳代謝的酶， 也是用于合成L- 谷氨酰胺（L-Gln） 過程中的關鍵酶， 現(xiàn)已在細菌、 真菌和植物中廣泛研究了涉及谷氨酰胺代謝的基因。 楊帆等人[30]研究表明蘇云金芽胞桿菌glnA 基因受glnR 的調控， 在氮源豐富的條件下， glnR 可以抑制glnA 的轉錄； 而在營養(yǎng)充足的條件下， glnR 基因缺失會導致谷氨酰胺合成酶基因glnA 的表達增加。 白婧等人[31]研究表明重組菌BJ2 有最高的GS 酶活力， 利于L-Gln 的合成， 從而最終得到高產量的L-Gln。

非核糖體肽合成酶（ NRPS） 是一種多功能酶，可以在沒有核糖體參與的情況下整合短肽[32]， 合成的非核糖體多肽類次生代謝產物結構和功能具有多樣性， 是活性物質的重要組成部分[33]。 在許多真菌中，如旋孢腔菌（Cochliobolus）、 鐮刀菌（Fusarium） 、 葡萄灰霉菌（Botrytis） 等都富含NRPS 基因[34-35]。 稻瘟病菌中的NRPS 在病原菌適應各種環(huán)境、 干擾寄主代謝并最終導致植物細胞死亡的過程中發(fā)揮作用[36]。

3.2 分解代謝酶

過氧化氫酶（CAT） 是生物防御體系的一大關鍵酶， 絕大多數(shù)需氧微生物都含有CAT， 其主要作用是使過氧化氫（H2O2） 還原成水和氧氣。 過氧化氫可以被還原成各種有害的自由基， 氧化細胞中的各種成分， 引起細胞病變[37]。 而CAT 可促使H2O2分解， 使之處于較低水平， 從而有效防止有毒物質在生物體內累積， 使細胞免于遭受H2O2的毒害， 可反映多種環(huán)境因子對生物生理生化過程的影響。 張曉麗[38]研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭的其中一種揮發(fā)物Carvacrol，可以使得稻瘟病菌的CAT 酶活性降低， 解毒力下降，菌體死亡。

海藻糖酶（THL） 可以將生物體內的海藻糖水解為2 分子葡萄糖， 在真菌代謝系統(tǒng)中有十分重要的作用。 海藻糖存在于真菌孢子、 子實體和菌絲等營養(yǎng)細胞中。 真菌萌發(fā)后， 海藻糖被迅速消耗， 用于真菌的核心代謝和對特定環(huán)境刺激的應答[39]。

胰蛋白酶（ Trypsin） 是致病真菌的重要毒力因子。 真菌胞外胰蛋白酶參與真菌侵染的過程， 減緩宿主細胞的增殖、 減少宿主細胞的黏附[40]。 韓志萍等人[41]研究顯示， 從放線菌中提取的leupeptin 對桔黃賽多孢菌胰蛋白酶有100%的抑制效果， 其次是從利馬豆中提取的LBTI， 其抑制效果也高于95%， 其余專一抑制劑的抑制效果均大于70%。 邵彪等人[42]純化了黑豆胰蛋白酶抑制劑并發(fā)現(xiàn)其對植物致病蘋果輪紋病菌、 瓜果腐霉病菌和白菜黑斑病菌有明顯抑制作用， 通過抑制植物病原真菌分泌的蛋白酶活性，干擾其對環(huán)境中營養(yǎng)物質的分解利用， 從而限制和阻礙真菌的生長。

3.3 氧化還原代謝酶

超氧化物歧化酶（SOD） 是重要的內源活性氧清除劑， 能夠催化O2-轉化成H2O2和O2， 保持細胞膜的結構和功能。 植物在逆境下出現(xiàn)的傷害或植物對逆境的抵抗能力往往與體內SOD 活性相關。 活性氧的積累， 傷害了植物的細胞膜系統(tǒng)， 同時也可以直接殺傷病原菌、 作為信號分子等作用參與植物抗病性的表達。 宋福強等人[43]研究表明， 用菌株B.ochroleuca 發(fā)酵產物處理的F.oxysporum.sp cucumebrium 和A.solani， 其菌絲體內超氧化物歧化酶活性明顯降低， 破壞了菌絲體的生物膜， 抑制菌絲的生長而死亡。 沈鳳俊等人[44]研究表明， 銀杏酸使球黑孢霉細胞膜通透性變高， 菌絲體蛋白質外泄， 降低了球黑孢霉菌絲體中SOD 酶活力， 對球黑孢霉呈現(xiàn)抑制作用。

多酚氧化酶（PPO） 普遍存在于植物、 真菌、 昆蟲的質體中， 可催化醌和單寧的合成， 醌類參與細胞壁物質的合成及代謝， 能與蛋白質等大分子物質形成聚合物， 限制病原菌的擴展。 鄧勛等人[45]研究表明， 在逆境脅迫下， 前期樟子松枯梢病菌的多酚氧化酶活性呈上升趨勢， 發(fā)揮對菌體的保護作用， 到了后期由于氧自由基和膜脂過氧化的加重， 使細胞透性增加， 蛋白質變性嚴重， 最終導致各種酶含量的降低， 造成菌體死亡。 朱琳等人[46]研究表明受抑制的致病疫霉菌絲體內PPO 酶活性顯著下降。

琥珀酸脫氫酶（ SDH） 是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈的關鍵酶。 其活性直接影響電子傳遞鏈和呼吸氧化， 在呼吸鏈和三羧酸循環(huán)中極其重要[47]。 同時，SDH 是細胞能量代謝的重要酶， 其活性變化可反映細胞的能量代謝情況。 李麗萍等人[48]研究發(fā)現(xiàn)， 紫莖澤蘭的活性物質對番茄青枯菌有明顯的抑制作用，抑制某些蛋白質的合成， 降低SDH 的比活力， 導致影響菌的代謝。 李沖偉等人[49]研究發(fā)現(xiàn)金黃殼囊孢菌菌絲體細胞的SDH 酶活受到了木霉提取物的抑制和破壞， 導致整個TCA 循環(huán)的停滯。

4 參與DNA 或RNA 轉錄過程的酶類

轉錄是遺傳信息從DNA 流向RNA 的過程， 一旦轉錄過程受到抑制， 阻止遺傳物質的合成， 導致菌體細胞死亡。 目前， 國內外對于病原菌中參與DNA 或RNA 轉錄過程酶類的研究較少， 基于更多相關酶活性對病原菌抑制作用有待進一步研究。

4.1 尿嘧啶磷酸核糖轉移酶

尿嘧啶磷酸核糖轉移酶（UPRT） 是一種嘧啶合成補救酶， 可特異性作用于尿嘧啶及其類似物， 可催化合成嘧啶核苷酸前體UMP。 基因編碼UPRT 的反向篩選標記基因尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因（upp） ， 將胸腺嘧啶類似物5- 氟尿嘧啶（5-FU） 轉化為5- 氟單磷酸脫氧尿嘧啶， 從而抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的活性并導致細胞死亡[50]。

4.2 DNA 聚合酶

DNA 聚合酶是以親代DNA 為模板， 催化底物dNTP 分子聚合形成子代DNA 的一類酶。 孫峋等人[51]研究表明， 迷迭香酸可以改變細菌細胞膜的通透性，導致還原糖和蛋白質的滲漏， 影響細胞代謝， 并通過抑制DNA 聚合酶的活性來影響DNA 復制， 從而起到抑菌作用。

4.3 DNA 拓撲異構酶

DNA 拓撲異構酶就是調控核酸代謝的關鍵酶之一， 其可催化DNA 鏈的解旋和斷裂， 完成DNA 的復制、 轉錄等過程。 抑制酶活性可以穩(wěn)定拓撲異構酶-DNA 復合體， 從而抑制翻譯和復制， 最終阻礙DNA 合成和細胞分裂， 導致細胞死亡。 喜樹堿及其衍生物在體外能有效抑制新型隱球菌拓撲異構酶I 的活性， 拓撲異構酶Ⅱ抑制劑依賴于泊苷對念珠菌的抗菌活性較弱[52]。

5 結語

綜上所述， 已有眾多研究結果發(fā)現(xiàn)， 抑菌物質可通過對病原菌的幾丁質酶、 β-1,3 葡聚糖酶、 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、 纖維素酶、 IPC 合成酶、 α-1,4 去甲基化酶、 過氧化物酶等酶活性的作用， 抑制病原菌的生長繁殖。 目前， 國內外研究中， 基于細胞壁相關酶（ 幾丁質酶、 β-1,3 葡聚糖酶） 活性研究抑制作用的報道較多， 但其他酶類研究報道較少，有待進一步研究， 從而能更全面、 更有力地論證抑菌物質對病原菌的抑制機制。