張聲峰 陳碩昌 梁文鳳 嚴(yán)祥 馮藝峰 李桂珍 楊輝

摘要：【目的】從自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥產(chǎn)品中篩選功能芽孢桿菌，為油茶殼堆肥高效生產(chǎn)、飼料發(fā)酵等應(yīng)用提供菌劑?！痉椒ā坷酶咄繙y(cè)序技術(shù)測(cè)定廣西某油茶殼堆肥中微生物群落分布，篩選適宜堆肥微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基以獲得多樣性較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群，經(jīng)平板稀釋涂布法分離純化菌株，使用水解圈法和酶活測(cè)定方法進(jìn)行水解酶功能分析，利用菌株形態(tài)特征觀察、16S rDNA分子鑒定法明確菌株的種屬，并運(yùn)用分子生物學(xué)軟件MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用重鉻酸鉀法測(cè)定腐殖酸含量?！窘Y(jié)果】芽孢桿菌科（Bacillaceae）是優(yōu)勢(shì)菌科，占比達(dá)55.58%;分離到15株芽孢桿菌，同時(shí)具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株;同時(shí)具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株;儀具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。其中菌株Bacillus sp.YXI1的蛋白酶活力達(dá)到27 07±3.28 U-mL-1，淀粉酶活力達(dá)123 97±3.19 U-mL-1，纖維素酶活力達(dá)15 75±0.23 U-mL-1。含有這15株菌的復(fù)合菌制劑有利于腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)?！窘Y(jié)論】鑒定出的Bacillus cereus YX02和Bacillusflexus FYF01等菌株具有進(jìn)一步研究丌發(fā)的價(jià)值，可用于開發(fā)油茶殼堆肥微生物菌制劑。

關(guān)鍵詞：油茶殼堆肥;芽孢桿菌;功能性;篩選;應(yīng)用

中圖分類號(hào)：X 712;X53

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-03 84（ 2021） 07-0843-12

Functional Bacillus Species in Camellia Seed Shell Compost

ZHANGShengfeng 1， CHENShuochang 1， LIANGWenfeng 1， YANXiang 1. FENGYifeng 1， LIGuizhen 2. YANGHui 1*

（ I. College ofLife Science and Technology， Guangxi UniTJersity. Nanning， Guangxi 530004. China;

2. Guangxi Academy ofForestry Sciences， Nanning， Guangxi 530000， China ）

Abstract：【Objective】Bacillus spp that contribute to the fermentation of Camellia oleifera seed shells were isolated foreffective composting of the waste material. 【Method】 The microbial community in natural camellia seed shell compostfound in Guangxi was studied using the high-throughput sequencing technology. Suitable culture medium to foster the growthof richly diverse Bacillus spp from the compost was selected. Flora isolation by dilution with a streaking plate methodfollowed. The hydrolase activities of the isolates were determined by using the hydrolysis circle method and enzyme activityanalysis， the species identified by a 16S rDNA analysis， and the phylogeny constructed by MEGAX. The content of humic acidin the compost was measured by a potassium dichromate method. 【Result】 Bacillaceae was the dominant family in thecompost. It accounted for 55.58% of all isolated flora. Among the 15 Bacillus isolates. 6 exhibited activities of amylase，cellulase， and protease， one of amylase and cellulase. and 2 0f protease or protease. Strain YXI I showed a protease activity of27.07+3.28 U·mL-1. an amylase activity of 123.971- 3.19 U·mL-1. and a cellulase activity of 15.75+0.23 U·mL-1 In thepresence of numerous Bacillus spp that secreted varieties of hydrolases， formation of humic acid in the compost was enhanced.【Conclusion】 Some of the isolated strains. such as B. cereus YX02 and B. flexus FYFOI， might warrant further investigationto develop microbial inoculants for efficient composting camellia seed shells.

Key words： camellia seed shell compost; bacillus; functional; screening; application

0 引言

【研究意義】油茶是我國特有的木本食用油料樹種。油茶殼是油茶果實(shí)加工茶油的副產(chǎn)品，隨著油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，每年都有大量油茶殼產(chǎn)生。油茶殼占整個(gè)油茶果實(shí)質(zhì)量的60%以上，其主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素[1]，已經(jīng)在有機(jī)肥料、鉀鹽、活性炭的生產(chǎn)中得到利用，具有廣闊的發(fā)展空間與市場(chǎng)空間‘糾。以油茶殼為主要原料的堆肥，可以把儲(chǔ)量豐富、價(jià)格低廉的油茶殼資源充分利用。油茶殼堆肥產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用，不僅減少對(duì)大氣、土壤、水質(zhì)的污染，也減少化肥投入，增加農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，提高了農(nóng)民收入?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微生物在堆肥生產(chǎn)中有重要的作用，添加微生物加速農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥的研究開發(fā)已經(jīng)比較普遍。如Shrestha等[3]進(jìn)行微生物強(qiáng)化牛瘤胃內(nèi)容物堆肥的研究。Song等[4]開發(fā)一種協(xié)同降解有機(jī)酸的微生物聯(lián)合體（ MCDOA），加速蛋白質(zhì)類化合物的降解和復(fù)雜的類腐殖質(zhì)物質(zhì)的形成，并改善醋酸、丙酸降解菌和木質(zhì)素降解菌的原生菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，有效縮短餐廚垃圾堆肥周期。Yu等[5]將嗜熱芽孢桿菌接種于污泥堆肥中，提高了堆肥的質(zhì)量和效率。由于芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥生產(chǎn)中有重要作用，其現(xiàn)已成為應(yīng)用最多的微生物菌制劑[6.7]，如：可以從堆肥中分離出降解纖維素的嗜熱芽孢桿菌[8];將松樹皮制成堆肥，接種芽孢桿菌屬等有益的微生物，可以增強(qiáng)對(duì)樹木根病菌的抑制作用，減少在苗圃使用殺菌劑[9];以蘿卜細(xì)菌性葉斑病為例，探討堆肥對(duì)植物葉面病害的抑制作用，并對(duì)堆肥中可能起抑制作用的根際細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)抑制病害最顯著的是芽孢桿菌屬[1O];利用芽孢桿菌研制固體菌制劑可促進(jìn)園林廢棄物堆肥過程中木質(zhì)素、纖維素的降解和腐殖質(zhì)的合成[ll];從完全腐熟的餐廚垃圾有機(jī)肥中篩選出芽孢桿菌復(fù)合菌劑，能夠明顯縮短堆肥周期和提高餐廚垃圾降解率[12]。這些研究表明芽孢桿菌具有降解纖維素、抑制致病菌、提高餐廚垃圾降解率和縮短堆肥周期等功能。【本研究切入點(diǎn)】目前，油茶殼堆肥存在生產(chǎn)效率低和品質(zhì)不高等問題，對(duì)油茶殼堆肥的研究報(bào)道[13-15]還比較少，且對(duì)油茶殼堆肥中功能性芽孢桿菌的研究有待進(jìn)一步深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測(cè)序技術(shù)[16]探究廣西某農(nóng)場(chǎng)自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥產(chǎn)品中的微生物多樣性組成，再通過選擇合適的培養(yǎng)基，獲得實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下物種多樣性相對(duì)比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。從中篩選具有水解酶功能特性和其他功能特點(diǎn)的芽孢桿菌，并應(yīng)用16S rDNA鑒定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分類學(xué)地位，最終完成應(yīng)用效果試驗(yàn)。為今后開發(fā)油茶殼堆肥微生物菌制劑、提升油茶殼堆肥的生產(chǎn)效率和品質(zhì)，以及飼料發(fā)酵等應(yīng)用方面提供了菌種資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來源 堆肥樣品來自廣西某農(nóng)場(chǎng)自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥，呈褐色固體顆?；驁F(tuán)狀，pH7.96，含水率37.35%。

1.1.2試劑 EazyTaq酶，北京聚合美生物科技有限公司生產(chǎn)，XDNA/HindⅢDNA Marker、DL2000 DNAMarker、dNTPMix，TaKaRa試劑（大連）公司生產(chǎn);柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);革蘭氏染色液，購白廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;酵母粉和蛋白胨，均購白Oxoid（英國）公司;MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒，購白美國Illumina公司;biowest agArose瓊脂糖，購白西班牙biowest公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 采用的4種常規(guī)培養(yǎng)基：（1） LB培養(yǎng)基[17]。（2）淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 9.L 1，NaC15g·L-l，牛肉膏5 g·L-l，可溶性淀粉10 g·L-l，瓊脂15 g·L-l，pH 7.0～7.2。（3）脫脂乳培養(yǎng)基：用于蛋白酶活性的鑒定試驗(yàn)，分別配制A液和B液。A液：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 h，NaC1 0.5 g，瓊脂2 g，pH7.0～7.2，共50 mL;B液：脫脂奶粉3 g，pH 7.0～7.2，50 mL。A、B單獨(dú)滅菌，使用時(shí)混合。（4）剛果紅纖維素培養(yǎng)基：K2HP04 0.5 g·L-l，MgS04 0.25g·L-l，剛果紅0.2 g·L_1，CMC-Na 2 g·L-l，NaC11.0g·L-l，瓊脂20 g·L-l，pH 7.0-- 7.2。通過參考適宜芽孢桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基[18-20]，設(shè)定堆肥微生物生長(zhǎng)的6組篩選培養(yǎng)基：M1：紅糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L_1，硫酸銨4 9.L_1，MgS04 1 9.L 1，MriS040.03 g·L_1，蛋白胨4 g·L-1，pH 7.0～7.2; M2：葡萄糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L-l，硫酸銨4 g·L-l，MgS04 1 g·L-l，MnS04 0.03 g·L-l，蛋白胨4 g·L_1，pH 7.0-- 7.2; M3：紅糖5 g·L-l，酵母粉3 g.L-l，NaC1 2 g·L-l，乙酸鈉5 g·L-l，L一半胱氨酸鹽0.5 g·L-l，可溶性淀粉1 g·L-l，蛋白胨5 g·L-l，pH7.0—7.2;M4：葡萄糖20 9.L-1，酵母粉4 g·L_1，乙酸鈉5 g·L_1，硫酸銨2 g·L-1，MgS04 0.5 g·L-1，MnS04 0.2 g·L-1，蛋白胨12 g·L-1，檸檬酸氫二胺2 g·L-1，吐溫一80 1 g·L-1，CaC03 2 g·L-1，K2HP040.5 g·L-1，pH 7.0～7.2;M5：紅糖5 g·L-1，F(xiàn)eS040.2 g·L-1，KC1 0.5 g·L-1，硫酸銨3 g·L-1，MgS040.5 g·L-1，MnS04 0.06 g·L-1，K2HP04 4 g·L-1，pH7.0～7.2;M6：紅糖10 g·L-1，酵母粉2 g·L-1，豆粕2 g·L-1，尿素10 g.L-1，pH 7.0～7.2。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1油茶殼堆肥微生物多樣性分析 采集適量油茶殼堆肥樣品，送至Shanghai Majorbio Bio—pharmTec11110109y Co.Ltd完成16S rDNA高通量測(cè)序，細(xì)菌的通用引物序列為：806R（5'一GGACTACHVGGGTWTCTAAT一3 '）與338F（5 '一ACTCCT—ACGGGAGGCAGCAG一3 '）;測(cè)序區(qū)域V3～V4區(qū)，測(cè)序平臺(tái)為IIIumina MiSeq。使用UPARSE軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），以97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行0TU聚類，以UCHIME軟件剔除嵌合體。通過RDP classifier對(duì)測(cè)定的序列完成物種分類注釋，然后比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫（SSU128），設(shè)置70%的比對(duì)閾值最終確定堆肥中微生物的種群結(jié)構(gòu)。

1.2.2堆肥微生物培養(yǎng)基的篩選 比較Ml—M6共6組培養(yǎng)基對(duì)堆肥微生物生長(zhǎng)的影響，每組培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組，代表3種培養(yǎng)條件：膠塞封口厭氧靜置培養(yǎng)，按M1～M6編號(hào)為1一Y，2一Y，3一Y，4一Y，5一Y，6一Y;紗布封口好氧靜置培養(yǎng)，按M1～M6編號(hào)為1一HJ，2一HJ，3一HJ，4一HJ，5一HJ，6一HJ;紗布封口好氧搖床培養(yǎng)（100 r.min-1），按M1～M6編號(hào)為1一HY，2一HY，3一HY，4一HY，5一HY，6一HY。初始pH均為7.0～7.2。將新鮮堆肥樣品的無菌生理鹽水洗滌液以1%的量接種于各培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃。于培養(yǎng)后的第1、2、3、5、7、15、22、30 d，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D600值。培養(yǎng)后的第3、7、15、30 d，使用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)原核微生物菌數(shù)，并使用光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)液的微生物形態(tài)。

1.2.3芽孢桿菌平板初篩 堆肥樣品經(jīng)最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用十倍稀釋法[21]涂布平板，分離單菌落。

1.2.4菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 在平板上觀察菌株的菌落形態(tài)、菌落顏色和質(zhì)地等，并挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色[22]。

1.2.5菌株的16S rDNA鑒定 分別提取菌株基因組DNA[23]，通過PCR擴(kuò)增其16S rDNA'2]，送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果進(jìn)行核酸BLAST[25]分析比對(duì)，利用MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。

1.2.6菌株的水解酶功能的初篩和測(cè)定

（1）水解酶活性的平板初篩

蛋白酶活性的初篩：將經(jīng)純化菌株點(diǎn)種在脫脂乳培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)基的周圍是否產(chǎn)生透明的水解圈[27]。淀粉酶活性的初篩：使用Elamary等[28]的方法對(duì)菌株淀粉酶水解活性進(jìn)行了篩選，水解圈的出現(xiàn)作為菌株產(chǎn)淀粉酶的依據(jù)。纖維素酶活性的初篩：使用剛果紅纖維素培養(yǎng)基法，進(jìn)行纖維素酶活性鑒定[29]。

（2）菌株的基礎(chǔ)發(fā)酵

將菌株接種到LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24h后測(cè)定水解酶活性。

（3）水解酶活力的測(cè)定

粗酶液的制備：將初篩菌株的發(fā)酵液于4℃、8000 r·mm-1條件下離心10 min，除菌體后上清液即為粗酶液。蛋白酶活力檢測(cè)采用福林酚法[30]，蛋白酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.8的條件下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1 ug酪氨酸的酶量。淀粉酶活力檢測(cè)采用曹丹等[31]使用的方法，淀粉酶活力單位定義為在37℃、pH 6.0的條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成1 ug還原糖的酶量。纖維素酶活力檢測(cè)采用DNS法[32]，酶活定義為在37℃、pH5.5的條件下每分鐘催化羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 ug葡萄糖的酶量。

1.2.7菌株在油荼殼堆肥中的應(yīng)用試驗(yàn) 將篩到的15株菌使用LB發(fā)酵培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)24 h，然后各取l mL混合，制成微生物菌制劑。設(shè)置一個(gè)添加菌制劑的試驗(yàn)組，不添加菌制劑的對(duì)照組，每個(gè)組3個(gè)平行。使用250 mL三角瓶，各試劑按表1的配方添加，初始pH 7.2，紗布封口，于37℃下，搖床轉(zhuǎn)速120 r.mm_1培養(yǎng)。使用重鉻酸鉀法[33]測(cè)定培養(yǎng)15 d的腐殖酸含量。

2結(jié)果與分析

2.1微生物群落分析結(jié)果

利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)油茶殼堆肥中微生物的多樣性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示（圖1），芽孢桿菌科（Bacillaceae）是堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌科，其占比達(dá)到55.58%，表明芽孢桿菌在油茶殼堆肥微生物中占主導(dǎo)地位。

2.2堆肥微生物在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果

采用M1—M6六組培養(yǎng)基在不同條件下培養(yǎng)堆肥微生物，培養(yǎng)液的OD600和菌數(shù)變化結(jié)果如圖2所示，結(jié)合鏡檢菌株形態(tài)多樣性分析，表明M2培養(yǎng)基最佳：在厭氧培養(yǎng)下菌數(shù)可達(dá)到（ 1.91±0.10）×108CFU·mL-1;好氧靜置培養(yǎng)下，菌數(shù)最高可達(dá)到（ 33.3±0.59）×lOs CFU.mL-l;好氧搖床培養(yǎng)下，菌數(shù)最高可達(dá)到（ 1.19±0.13）×lO 8 CFU·mL-l。且鏡檢結(jié)果表明，M2培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物多樣性更豐富。

2.3菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)平板劃線純化，分離到15株菌。它們?cè)贚B培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌落顏色和質(zhì)地等如表2所示。經(jīng)過染色后在光學(xué)顯微鏡下放大4 000倍觀察到的菌體形態(tài)，如圖3所示。

2.4菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果 將篩到的15株菌提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，如圖4所示，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小約為1.5 kb，與16S rDNA預(yù)期大小相符，可以用于測(cè)序分析。

2 .4.2菌株的16S rDNA序列分析 將分離到的菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)后與相似性高的菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化距離，鑒定YX02為蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus[34]）.YX15為海洋短桿菌（Brevibacteriumoceani[35]）.FYFOI為彎曲芽孢桿菌（Bacillusflexus[36]）。其他菌株由于在單獨(dú)比對(duì)時(shí)有多個(gè)芽孢桿菌屬內(nèi)不同種的芽孢菌株與其相似性都很高且進(jìn)化距離非常接近，單純依賴16S rDNA序列比對(duì)尚不能準(zhǔn)確鑒定到種，只能初步鑒定到芽孢桿菌屬。從油茶殼堆肥中分離出的15菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果見表3。

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，從發(fā)育樹可以看到，有12株菌暫時(shí)鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）的不同菌株。比如菌株YX03、YX16、YX11和YX13，以及菌株FYF07、FYF04和FYFlO，在進(jìn)化距離上非常接近，但根據(jù)菌落形態(tài)特征不同以及水解酶活性的差異，可推斷是同一屬內(nèi)的不同菌株。在今后的研究中，將通過生理生化、DNA分子雜交技術(shù)鑒定等方式，進(jìn)一步確定這些菌株的菌種類別。

2.5酶學(xué)水解酶活性的初步鑒定結(jié)果

2.5.1蛋白酶活性分析 將各菌株點(diǎn)種在脫脂乳培養(yǎng)基上，平板初篩蛋白酶的結(jié)果見表4所示。有7株菌產(chǎn)生蛋白酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYF04，其次是菌株FYF07。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)蛋白酶能力的大小，但還需要測(cè)定發(fā)酵液中酶的活性，以進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的產(chǎn)酶能力。

2.5.2淀粉酶活性分析 將各菌株點(diǎn)種在淀粉培養(yǎng)基上，平板初篩淀粉酶的結(jié)果如表4所示，共有7株菌產(chǎn)生淀粉酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株YXI1，其次是菌株FYF01。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)淀粉酶能力的大小，但還需要測(cè)定發(fā)酵液中酶的活性，以進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的產(chǎn)淀粉酶的能力。

2.5.3纖維素酶活性分析 將各菌株點(diǎn)種在剛果紅培養(yǎng)基上，平板初篩纖維素酶的結(jié)果如表4所示，共有8株菌產(chǎn)生纖維素酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYFOI，其次是菌株FYF04。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)纖維素酶能力的大小，但還需要測(cè)定發(fā)酵液中酶的活性，以進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力。

2.5.4三種水解酶活力的測(cè)定 將各菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測(cè)定粗酶液的水解酶的活力。最終初步測(cè)定初篩菌株的各酶活力的結(jié)果如圖6所示。其中，蛋白酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX11，27 07±3.28U·mL-l; Bacillus sp.FYFlO次之， 為13.67±3.18U·mL-1。淀粉酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX13，達(dá)144.10±2.65 U-mL-l; Bacillus sp.YXlI次之，為123.97±3.19 U·mL-l。纖維素酶活力最高菌株是Bacillus sp.YXI1，達(dá)15.75±0.23 U·mL-l; Bacillus sp.YX03次之，為13.83±0.10 U·mL-l。

這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時(shí)具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶三種水解酶活性的菌株有6株，同時(shí)具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株，僅具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。表明這些菌株在油茶殼堆肥中具有促進(jìn)纖維素向小分子葡萄糖轉(zhuǎn)化、促進(jìn)蛋白質(zhì)向小分子肽和氨基酸轉(zhuǎn)化以及促進(jìn)淀粉向小分子麥芽糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化的功能性作用。

2.6菌株在油茶殼堆肥中的初步應(yīng)用

腐殖酸是堆肥過程中生成的最具代表性的次生產(chǎn)物，對(duì)于肥料的發(fā)酵腐熟程度具有一定的表征性，是衡量堆肥品質(zhì)的重要指標(biāo)。培養(yǎng)15 d后，測(cè)定添加15株菌菌制劑的試驗(yàn)組腐殖酸平均含量是7.08%，是對(duì)照組腐殖酸平均含量（5.68%）的1.25倍，如圖7所示。試驗(yàn)組高于對(duì)照組，添加15株菌的菌制劑有利于油茶殼堆肥腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)。

3討論

目前，研究農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥中微生物的影響和作用機(jī)理的研究報(bào)道已經(jīng)比較普遍。其中有關(guān)微生物水解酶的研究已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一，且已有很多研究證實(shí)，芽孢桿菌分泌的水解酶對(duì)纖維素或蛋白質(zhì)的降解尤為關(guān)鍵。如Liu等[37]研究了城市固體廢物堆肥中不同堆肥階段產(chǎn)纖維素酶的關(guān)鍵微生物種群，發(fā)現(xiàn)纖維素的有效分解依賴于細(xì)菌和真菌的協(xié)同作用。聶文翰等[38]將含有芽孢桿菌的復(fù)合菌劑添加到秸稈堆肥中，施加這種秸稈堆肥后，土壤纖維素酶活性提高了30.8%，普通白菜產(chǎn)量比對(duì)照組提高46.4%。從高溫堆肥中分離到1株芽孢桿菌（Geobacillus stearotherrriophilus），在最適條件下能分泌大量的降解木質(zhì)纖維素的酶，被認(rèn)為是一種潛在的提高堆肥效率的菌種[39]。在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品豆粕微生物發(fā)酵中添加蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和糞腸球菌，抗原蛋白降解率達(dá)到90%以上[40]。本研究探索了自然狀態(tài)下油茶殼堆肥中的芽孢桿菌，9株芽孢桿菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時(shí)具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株。因此，在后續(xù)研究中，利用微生物發(fā)酵工藝條件優(yōu)化以及酶活測(cè)定方法，集中對(duì)產(chǎn)酶活性較強(qiáng)的菌株的研究，以期獲得高產(chǎn)纖維素酶或蛋白酶的微生物，有助于提升油茶殼堆肥的生產(chǎn)效率和提高堆肥品質(zhì)，并將在飼用酶制劑中具有較大的應(yīng)用潛力。

此外，利用微生物來消除農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)藥污染是一種非常安全、經(jīng)濟(jì)、有效的方法[41]。本研究從油茶殼堆肥中篩選到蠟狀芽孢桿菌，即菌株Bacilluscereus YX02。關(guān)于蠟狀芽孢桿菌的報(bào)道已有很多，如研究了對(duì)重金屬鉛、鋅、鉻有強(qiáng)吸附能力的一株蠟狀芽孢桿菌[42]，完成了蠟狀芽孢桿菌吸附鉛的研究[43]，分離鑒定了強(qiáng)抗鎘蠟狀芽孢桿菌[44]，發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌對(duì)毒死蜱有很高的降解率[45]。也有研究證實(shí)，利用植物高羊茅與羊茅共植，結(jié)合蠟狀芽孢桿菌，可顯著修復(fù)被重金屬與十溴二苯醚BDE-209共污染的土壤[46];從礦山尾礦中分離到的蠟狀芽孢桿菌（ TIB3），具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性，并可以提高植物修復(fù)重金屬污染的效率[47]。這些結(jié)論表明了本研究發(fā)現(xiàn)的菌株（Bacillus cereus YX02）可能具有處理重金屬、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和消除農(nóng)藥污染的應(yīng)用價(jià)值。另外，本研究中篩選到的菌株FYF01是彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）。已有研究表明某些彎曲芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、處理造紙廢水、殺滅害蟲等應(yīng)用價(jià)值。如彎曲芽孢桿菌在鹽脅迫下能促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)，在鹽漬土的植物修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用前景[48];一株彎曲芽孢桿菌能夠降解堿木質(zhì)素，利用該菌能夠處理復(fù)雜的造紙廢水，是一種很有前途的微生物修復(fù)劑[49];一種彎曲芽孢桿菌對(duì)蒽醌類染料有脫色和脫毒作用，可用于染料廢水的生物處理[50];彎曲芽孢桿菌可以成為生物殺蟲劑，用作合成殺蟲劑的環(huán)境安全替代品[51]。在今后的研究中，將繼續(xù)挖掘菌株上述方面的功能，或?qū)橛筒铓ざ逊十a(chǎn)品增加改善生態(tài)環(huán)境的作用提供理論依據(jù)和菌種資源。

當(dāng)今世界常年大量使用化學(xué)農(nóng)藥和肥料，土壤結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重污染和破壞，這給生態(tài)環(huán)境帶來災(zāi)難性后果。因此，各國競(jìng)相研究和開發(fā)微生物資源，希望研制出高效、無毒、無污染的微生物肥料和農(nóng)藥。開發(fā)微生物復(fù)合菌制劑，利用群落協(xié)同作用以增強(qiáng)微生物的處理能力已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢(shì)。比如韓國蔚山的B3（Bio-Best Bacillus）工藝，是先進(jìn)的污水處理系統(tǒng)。它的主要原理是利用一個(gè)以芽孢桿菌占優(yōu)勢(shì)的微生物群落處理污水，能夠有效地去除氮、磷和有機(jī)物[52]。本研究中這些功能性芽孢桿菌，在今后的研究中，將繼續(xù)探究它們?cè)诖龠M(jìn)植物生長(zhǎng)、處理重金屬、消除污染或殺滅害蟲等方面的功能。以這些功能微生物作為優(yōu)勢(shì)菌種，進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，提高它們的產(chǎn)酶能力和菌密度，充分利用功能性芽孢桿菌種群的協(xié)同作用。在油茶殼堆肥中發(fā)現(xiàn)的這些獨(dú)特功能的芽孢桿菌，或?qū)?duì)開發(fā)出一種既可以消除土壤污染，又能同時(shí)殺死農(nóng)業(yè)害蟲的生物肥料有所啟發(fā)。

4結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)，確認(rèn)芽孢桿菌科（Bacillaceae）是油茶殼自然堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌科，其占比達(dá)到55.58%，對(duì)油茶殼堆肥中微生物的群落結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步了解。通過6組培養(yǎng)基的堆肥微生物培養(yǎng)試驗(yàn)，篩選出相對(duì)最佳的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，獲得了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下物種多樣性相對(duì)比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。最終分離出15株芽孢桿菌，其中有3株菌明確了種屬，分別是Bacillus cereus YX02，Brevibacteriumoceani YX15，和Bacillus flexus FYF01，它們有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、消除污染和殺滅農(nóng)業(yè)害蟲的潛在應(yīng)用價(jià)值。這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，包括Bacillus sp.YXI1等6株菌同時(shí)具有3種水解酶的特性。如菌株Bacillus sp. YXIl的蛋白酶活力達(dá)到27.07±3.28 U·mL-I，淀粉酶活力達(dá)123.97±3.19 U·mL-l，纖維素酶活力達(dá)15.75±0.23U·mL-l。這表明這些菌株在油茶殼堆肥和飼用酶制劑等方面有較大的應(yīng)用潛力。將分離到的15株芽孢桿菌制備復(fù)合菌劑，在油茶殼堆肥中獲得較好的初步應(yīng)用效果，促進(jìn)腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 ：林海清 ）

收稿日期：2021-0302初稿：2021-0425修改稿

作者簡(jiǎn)介：張聲峰（ 1990-），男，碩士研究生，研究方向：微生物工程（E-mail： 1908391037@st.gxu.edu.cn）

通信作者：楊輝（ 1972-），男，博士，高級(jí)工程師，研究方向：食品發(fā)酵和酶工程（E-nlail： huiy422@gxu.edu.cn）

基金項(xiàng)目：廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA20302021-7）;百色市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（百科20192129）：廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題（JA-20-04-02）