劉志聰　林麗麗

摘 要：目的：建立HPLC法測(cè)定10種潮州鳳凰茶葉中咖啡因的含量。方法：以Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18為分析柱，樣品進(jìn)樣體積為10?L。流動(dòng)相A為0.2%的乙腈溶液，流動(dòng)相B為55%甲醇，流速為1ml/min，柱溫箱為30℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)272nm。結(jié)果：在所選條件下，樣品中咖啡因與其它組分分離良好。在咖啡因濃度為0.02～0.16mg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)線性系數(shù)達(dá)到0.99999，加標(biāo)回收率97.75%～99.83%之間，平均回收率為98.65%，RSD=0.8177%。10種鳳凰單叢茶咖啡因含量在20.50-31.00mg/g之間。結(jié)論：該方法快速準(zhǔn)確，可用于茶葉中咖啡因含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;鳳凰單叢茶;咖啡因

中圖分類(lèi)號(hào) S571.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）17-0159-04

The Content Determination of Caffeine in Ten Kinds of Fenghuang Dancong Tea by HPLC

LIU Zhicong et al.

（School of Life sciences and Food Engineering， HanshanNormoal Universiy ，ChouZhou 521000， China）

Abstract：AIM： To establish an HPLC method for the content determination of caffeine in ten kinds of Fenghuang tea from Chaozhou. METHODS： We taked Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18 as analytical column， the inject volume was 10μL， and taked 0.2% acetonitrile solution as the mobile phase A and 55% methanol solution as the mobile phase B， flow rate was 1ml/min， the column temperature was 30℃，and the detection wavelength was 272nm.Under the selected conditions. RESULTS： The caffeine got an ideal separation with other compounds. The peak time of caffeine has a good liner relation with the peak area of caffeine when the concentration of caffeine range of 0.02 to 0.16mg/mL， and the relevant linear coefficient reached 0.99999（n= 5）. In addition， the adding standard recoveries were 97.75%～99.83%， the average recoveries were 98.65%， and RSD=0.8177% .The caffeine content of ten kinds of Fenghuang Dancong tea ranged from 20.50 to 31.00mg/g.CONCLUSION： This method was quick and accurate. Therefor it was suitable for the determination of caffeine in tea.

Key words：HPLC;Fenghuang Dancong tea;Caffeine

鳳凰茶產(chǎn)于廣東省潮州市鳳凰山區(qū)，屬于烏龍茶類(lèi)，是全國(guó)六大茶類(lèi)之一，具有生津止渴，減肥美容，防癌癥，抗衰老，降血脂等多種功能。鳳凰茶葉中含有多種生物堿，主要以咖啡因?yàn)橹?，咖啡因是一種弱堿性生物堿，在強(qiáng)光和高溫下穩(wěn)定性較差，脂溶性強(qiáng)，可溶于沸水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，易溶于二氯甲烷[1]。少量的咖啡因可以使身心處于一種興奮狀態(tài)，刺激機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)腎上腺素釋放入血，增高機(jī)體血糖水平，使注意力集中[2]。因?yàn)榭Х纫蚰艽龠M(jìn)新陳代謝，影響神經(jīng)、心臟和腎臟的功能，所以是一種重要的醫(yī)藥原料，但是，過(guò)量的咖啡因會(huì)使人精神疲倦、身體發(fā)顫、難以入睡、刺激胃黏膜[2]，因此不適合神經(jīng)衰弱者、孕婦、老人、兒童飲用。

目前測(cè)定咖啡因含量的方法很多，如薄層色譜法，紫外分光光度法和高效液相色譜法等。而薄層色譜法的分離效果直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，測(cè)定結(jié)果誤差較大。紫外分光光度法中，樣品的前處理過(guò)程復(fù)雜，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，測(cè)定結(jié)果往往偏高[3]。高效液相色譜法則具有分離度與準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)[3-7]。

鳳凰單叢按香型可分成10多個(gè)類(lèi)型，分別為黃桅香，芝蘭香，桂花香，蜜蘭香，玉蘭香，姜花香，杏仁香，茉莉香，肉桂香，夜來(lái)香，奇蘭香等[8]。在國(guó)內(nèi)外，對(duì)潮州鳳凰茶咖啡因含量的研究鮮有報(bào)道[9、10]，而對(duì)于不同香型之間咖啡因含量的差異還未見(jiàn)有報(bào)道，了解其咖啡因含量的差異性，可以為給人們根據(jù)身體的實(shí)際需要選擇購(gòu)買(mǎi)不同香型茶葉時(shí)提供咖啡因含量數(shù)據(jù)參考。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，對(duì)10種香型鳳凰茶葉中咖啡因的含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，比較研究了其中的差異性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 安捷倫1200高效液相色譜儀;KQ5200超聲波清洗器（ 昆山市超聲儀器有限公司）;萬(wàn)分之一電子分析天平（（型號(hào)：FA2004，上海精密科學(xué)儀器公司）;離心機(jī)（型號(hào)：湘儀L420，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：HHS-11-4，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;0.45?m微孔濾膜;咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（Cas：58-08-2）;雙蒸水;色譜純乙腈和甲醇等。

1.2 試驗(yàn)材料 10種試驗(yàn)材料為市售產(chǎn)于廣東省潮州市潮安區(qū)鳳凰鎮(zhèn)鳳凰山成茶，經(jīng)韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院鳳凰單叢茶種質(zhì)評(píng)價(jià)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室品評(píng)鑒定為春?jiǎn)螛海喪合悖核?，黃枝香，蜜蘭香，群體香，烏葉，杏仁香，玉蘭，芝蘭香，八仙。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4，6×250mm，5?m）;流動(dòng)相A為0.2%的乙腈溶液，流動(dòng)相B為55%甲醇，等梯度洗脫;流速為1mL/min;柱溫：30℃;紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)272nm;分析采集時(shí)間：10min;進(jìn)樣量：10?L。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 準(zhǔn)確移取濃度為0.16mg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品母液，以超純水作為稀釋液，配制濃度分別為0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.08mg/mL等一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4℃冰箱下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 待測(cè)樣品溶液的制備 稱(chēng)取10種茶葉樣品各0.50g，研磨后置于100mL錐形瓶中，分部加入50mL 90℃的熱水，在90℃的水浴中振蕩，繼續(xù)浸提10min后，離心10min（轉(zhuǎn)速：4000r/min），取10mL上層清液于500mL容量瓶中，用超純水釋至刻度，則得到10種鳳凰茶葉的水提液，將各香型茶葉的水提液過(guò)0.45?m微孔濾膜待測(cè)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)組分的定性 按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和10種香型鳳凰茶的樣品提取液進(jìn)行分析測(cè)定，上樣量為10?L。標(biāo)準(zhǔn)品在保留時(shí)間3.198min處出峰，峰形基線分離，高斯對(duì)稱(chēng)，峰形較好。以保留時(shí)間定性，樣品液測(cè)定同樣在保留時(shí)間3.198min出峰，定性為咖啡因的色譜峰，基線分離，峰形較好，滿足定量的要求，試驗(yàn)結(jié)果色譜圖見(jiàn)圖1～11。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 將“2.2.1” 配制好的咖啡因系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按“2.1”項(xiàng)色譜分析條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量：10?L。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，其結(jié)果見(jiàn)圖12。從圖12可知，在咖啡因濃度為0.02～0.16mg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，樣品液測(cè)定濃度均在校正曲線所取濃度點(diǎn)之間，線性回歸方程為Y=40137.0262X+12.191818，相關(guān)系數(shù)為r2=0.99999。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 在“2.1”項(xiàng)色譜分析測(cè)定條件下，對(duì)質(zhì)量濃度為0.16mg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)工作液連續(xù)進(jìn)樣分析6次，分別記錄其保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，在選定色譜條件下，精密度良好，能達(dá)到儀器分析檢測(cè)的要求。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取八仙茶葉樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分析測(cè)定，測(cè)得咖啡因的含量分別為0.0423，0.0417，0.0418，0.0425，0.0418，0.0419，RSD為0.7678%，表明同批樣品經(jīng)多次測(cè)定，重現(xiàn)性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)測(cè)定，咖啡因含量為0.0419mg/mL的八仙茶葉樣品溶液6份，各1mL，一份作為本底值，另外5份分別準(zhǔn)確加入1mL 0.016 mg/mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果顯示該方法具有較高的準(zhǔn)確度，結(jié)果表2。由表2可知，咖啡因的加標(biāo)回收率在97.75%～99.83%之間，平均回收率為98.65%，RSD=0.8177%，說(shuō)明本測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

2.3 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取10種茶葉樣品各0.50g，按“2.2.2”項(xiàng)法制備各種茶葉的咖啡因樣品提取液各3份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，用外標(biāo)法定量每一種茶葉的咖啡因含量，結(jié)果見(jiàn)圖13。由圖13可知，各種鳳凰單叢茶咖啡因含量存在差異性，杏仁香中咖啡因的含量最高，而群體香含量為最低，各種茶葉之間咖啡因含量由高到底為：杏仁香>春?jiǎn)螛海喪合悖?黃枝香>春水仙>烏葉>玉蘭>芝蘭香>蜜蘭香>八仙>群體香。

注：與群體香比較，（*）p<0.05and（**）p<0.01。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 咖啡因檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)在文獻(xiàn)中多報(bào)道為270nm[11]，272nm[12]和274nm[4]，因此以這3個(gè)波長(zhǎng)作為試驗(yàn)波長(zhǎng)選擇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)其它色譜檢測(cè)條件相同的情況下，對(duì)濃度為0.16mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明在波長(zhǎng)272nm下咖啡因的響應(yīng)因子要比波長(zhǎng)在270nm和274nm下大，考慮到靈敏度的因素[13]，故選擇272nm作為咖啡因的檢測(cè)的最大吸收波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 對(duì)于流動(dòng)相的優(yōu)化，本試驗(yàn)以參考文獻(xiàn)報(bào)道水∶甲醇（65∶35）[1]、甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸（20∶10∶70）[3]及甲醇∶水（5.5∶4.5）為流動(dòng)相[11]作為參考，配制流動(dòng)相所使用的試劑及比例進(jìn)行流動(dòng)相條件的優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)以0.2%的乙腈溶液為流動(dòng)相A，以55%甲醇為流動(dòng)相B時(shí)，保留時(shí)間適當(dāng)，峰形較好，咖啡因與其它組分分離良好（R>1.5）。因此以0.2%的乙腈溶液和55%甲醇分別作為咖啡因檢測(cè)的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定了10種香型潮州鳳凰茶樣品中咖啡因的含量，結(jié)果表明，各種香型鳳凰茶之間存在咖啡因含量的差異，其測(cè)定結(jié)果范圍在20.50～31.00mg/g之間，其中杏仁香中咖啡因的含量最高，而群體香含量為最低。用此方法能準(zhǔn)確測(cè)定潮州鳳凰茶中咖啡因的含量，方法靈敏度高，線性良好，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，能準(zhǔn)確的測(cè)定不同香型鳳凰茶的咖啡因含量品質(zhì)。

基金項(xiàng)目：廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2021B1212040015）。

作者簡(jiǎn)介：劉志聰（1983—），男，廣東興寧人，碩士研究生，從事天然活性產(chǎn)物的研究。? 收稿日期：2021-06-10

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（責(zé)編：王慧晴）