王志勇，李德鵬，李惠玲，王繁業(yè)

(青島科技大學化工學院,山東 青島 266042)

奧美拉唑?qū)儆谫|(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)，是手性亞砜的一種，是一類治療消化系統(tǒng)潰瘍性疾病的有效藥物，其立體構型與藥物的藥理活性等密切相關[1].手性亞砜的合成主要采用化學氧化法[2]，這種方法存在很多缺點，包括對環(huán)境不友好及重金屬殘留等[3].由于酶具有對映體選擇性，區(qū)域選擇性以及反應條件溫和等特點，使得利用酶促氧化前手性硫化物制備手性亞砜近年來備受關注[4].手性亞砜是一類具有重要價值的藥物，利用過氧化物酶催化硫醚的不對稱氧化制備手性亞砜一直是合成研究的探究熱點.一些過氧化物酶，包括辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)[5]、豆殼過氧化物酶(soy husk peroxidase，SHP)[6]、煙曲柳氯過氧化物酶[7]等，通過研究它們的反應機理[8]，證明這些酶均可用于制備手性亞砜.研究發(fā)現(xiàn)單酶[9-10]，肌紅蛋白[11]和細胞色素[12]可用來催化不對稱氧化合成亞砜化合物，然而也存在一些嚴重的缺點，如需要昂貴的輔助因子或輔助因子循環(huán)系統(tǒng)，有些則需使用昂貴且商業(yè)化程度較低的酶源.

本研究首次將從豆莢中提取的豆莢過氧化物酶(soybean pod peroxidase，SPP)用于硫醚的不對稱亞砜氧化制手性亞砜，SPP價廉易得，與種皮中的豆殼過氧化物酶(SHP)有所不同.SPP尚未有用于不對稱氧化的研究報道.微乳液體系適合于疏水底物的反應，而且酶在微乳液中具有超活性.在本研究中，由于疏水底物和產(chǎn)物的存在，因此選用油包水微乳液為反應介質(zhì).十六烷基三甲基溴化銨/氯仿/正丁醇/水是常用的油包水微乳液體系，適用于本反應體系.

本研究從大豆莢中提取SPP，在十六烷基三甲基溴化銨/氯仿/正丁醇/水構成的微乳液中，催化奧美拉唑硫醚氧化生成(S)-奧美拉唑.在酶催化不對稱氧化反應中，影響產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和對映體純度的因素很多，如反應溫度、W/O值(水和表面活性劑摩爾濃度之比，即水與CTAB之比)、底物濃度等，為提高(S)-奧美拉唑的收率，將采用RSM優(yōu)化不對稱亞砜氧化反應條件.

1 實驗材料

奧美拉唑硫醚購自濟南沃德化工有限公司，(S)-奧美拉唑購自蘇州維塔化工有限公司，奧美拉唑購自山東壽光富康藥業(yè)有限公司，鮮豆莢購自蔬菜市場.其他試劑均為分析純.

2 實驗方法

2.1 豆莢過氧化物酶的分離純化

清洗后的新鮮大豆豆莢用高速食品攪拌機破碎，轉(zhuǎn)速為15 000 r·min-1，然后在4 ℃磷酸鹽緩沖液中浸提2 h，用500目濾布過濾.濾液用質(zhì)量分數(shù)為12%的聚乙二醇(PEG 4000)和質(zhì)量分數(shù)為13%的K2HPO4構成的雙水相體系分離，超濾，利用鋅離子除雜，使用葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)分離純化.最后將濃縮液冷凍干燥，制得活性為160 U·mg-1的過氧化物酶粉末.

2.2 過氧化物酶催化油包水微乳中奧美拉唑硫醚制備(S)-奧美拉唑

在25 mL小錐形瓶中，用SPP催化油包水微乳中的奧美拉唑硫醚，加入CTAB(1.265 g)、氯仿(7.8 mL)、正丁醇(1.2 mL)、奧美拉唑硫醚，1 mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，制得W/O值為16的CTAB/氯仿/正丁醇/水油包水微乳液，最終SPP酶活性濃度范圍為240 ～ 3 200 U·mL-1.在微乳中加入H2O2引發(fā)亞砜氧化，反應溫度50 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，反應5 h.用注射器從反應介質(zhì)中取樣，在樣品中加入3倍蒸餾水以分離水相和有機相，有機相用于測定奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率和(S)-奧美拉唑產(chǎn)率.從反應混合物中取樣，采用 HPLC測定H2O2濃度.由于底物、產(chǎn)物在水中溶解度很小，所以，它們在水中殘留很小.

2.3 高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析

采用手性HPLC測定S構型和R構型的奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率和(S)-奧美拉唑產(chǎn)率.采用Agilent 1200 LC型液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，檢測波長為302 nm，柱溫為30 ℃，手性色譜柱為Amyose-SA(規(guī)格250 mm×4.6 mm，填料粒徑5 μm，日本維美希公司生產(chǎn)).流動相為體積比15∶85的乙腈-磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)，流速0.6 mL·min-1.測定H2O2濃度的色譜柱為Inertsil ODS-SP(規(guī)格為15 mm × 4.6 mm，填料5 μm)，流動相為體積比2∶8的甲醇和水，檢測波長220 nm，流速0.5 ml·min-1.(S)-奧美拉唑的保留時間為6.96 min，(R)-奧美拉唑的保留時間8.28 min.

2.4 (S)-奧美拉唑核磁譜圖數(shù)據(jù)

1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)，δ:8.10 (s，1H)，7.51 (d，J=7.5 Hz，1H)，7.09 (d，J=1.3 Hz，1H)，6.97 (dd，J=7.5，1.3 Hz，1H)，5.00 (s，1H)，4.76 (s，2H)，3.87 (s，3H)，3.69 (s，3H)，2.23 (s，3H)，2.16 (s，3H)．

13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)，δ：166.19 (s)，164.25 (s)，158.20 (s)，150.87 (s)，149.70 (s)，140.20 (s)，139.29 (s)，127.52 (s)，126.29 (s)，116.18 (s)，114.20 (s)，99.81 (s)，61.27 (s)，59.86 (s)，55.56 (s)，12.94 (s)，11.28 (s)．

反應制得(S)-奧美拉唑的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)均與文獻[13]數(shù)據(jù)相符.

3 實驗設計與統(tǒng)計分析

通過單因素實驗，確定了SPP在油包水微乳液中催化亞砜氧化的主要影響因素.選取W/O值、H2O2濃度和溫度三個因子作為自變量，底物奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率作為因變量進行分析實驗，分別用A、C、T、Y表示.用Design Expert 8.0.6軟件設計實驗，共17個實驗點，表1給出設計的實驗方案的因素及水平.

表1 Box-Behnken實驗設計的因素和水平Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

4 實驗結果與討論

4.1 SPP催化奧美拉唑硫醚生物氧化制備(S)-奧美拉唑

SPP催化奧美拉唑硫醚生物氧化生成(S)-奧美拉唑的反應式為：

.

根據(jù)選定實驗點的條件，利用SPP催化奧美拉唑硫醚，測定奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率，實驗結果如表2所示.

利用RSM確定了最優(yōu)擬合模型(式1)，表3給出回歸分析結果，分析了W/O值(A)、H2O2濃度(C)和溫度(T)對奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率(Y)的影響.

表2 Box-Behnken設計和RSM產(chǎn)量結果Tab.2 Box-Behnken design and RSM output results

Y=93.16-0.37A+0.54C-0.84T+

0.47AC+0.43AT-0.50CT-3.86A2-

3.13C2-5.68T2，

(1)

式中，A為W/O值的水平，C為H2O2濃度的水平，T為反應溫度的水平，Y為奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率.

回歸模型式1中，系數(shù)為正時，表明該因素與響應值相應值正相關；反之，系數(shù)為負則說明為負相關.如式1所示：C、AC和AT的系數(shù)為正，表明如果提高這些因素，則奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率增加.在選定的17個試驗點的水平下，對擬合模型和模型中各單項式(如0.54C，—0.50CT)進行方差分析，分析結果如表3所示.

表3 擬合模型的方差分析Tab.3 Analysis of variance of the fitted model

續(xù)表3

4.2 各種因素交互作用對奧美拉唑硫化物轉(zhuǎn)化率的影響

根據(jù)該模型繪制了響應面圖，直觀地反映了各因素對奧美拉唑硫化物轉(zhuǎn)化率的影響.如圖1、圖2和圖3所示，每個圖都有兩個目標變量，而另一個變量的編碼值保持為零.W/O值(A)和H2O2濃度(C)對轉(zhuǎn)化率(Y)的影響如圖1所示：開始時轉(zhuǎn)化率隨W/O值的增加而增加，直到出現(xiàn)最大轉(zhuǎn)化率61.5% (W/O值約為16)；然后轉(zhuǎn)化率隨W/O值的增加而下降.W/O值直接影響微乳液中水核的尺寸，而水核大小是影響酶活性的關鍵因素，因而存在一個最佳W/O值使底物轉(zhuǎn)化率最大.在微乳液中，酶活性與W/O值的關系曲線形狀一般為鐘形曲線[14].在油包水微乳液中，W/O值對酶活性的影響很大[15-16].最優(yōu)W/O值表明油包水微乳液中的水核尺寸與酶分子的大小相適應，從而使酶表現(xiàn)出超活性.如果W/O值非常小，會導致大多數(shù)酶分子不能浸泡在水核中，而是直接在有機溶劑中失活；而當W/O值較大時，酶活性隨W/O值的增加而降低，這可能是由于微乳液中水分含量的增加所致[17].

反應介質(zhì)可能會改變過氧化物酶的構型偏好.SHP催化硫化物反應在水環(huán)境中的不對稱氧化有利于生成S構型，而在有機溶劑中則有利于生成R構型[18].本實驗研究的油包水型微乳液中，反應主要發(fā)生在水相，而不是有機相，因此SPP構型偏好應與在水中相同，為S構型.SPP和SHP的催化性能也可能存在一定的差異.在緩沖液中，SHP催化不對稱氧化生成手性亞砜，e.e.約為90%[6]，而已有報道無手性.HRP催化氧化表現(xiàn)出明顯的對映選擇性，在pH 7.0和4.5下，e.e.為60% ～ 70%[5].

圖2和圖3分別顯示了W/O值與溫度的相互作用以及H2O2濃度與溫度的相互作用.反應溫度會直接影響反應的活性和穩(wěn)定性[19].從圖2可見，反應的最適溫度為49.67 ℃，轉(zhuǎn)化率為93.75%，HRP通常工作在20～30 ℃之間，說明SPP的熱穩(wěn)定性高于HRP.當溫度高于50 ℃后繼續(xù)升高溫度時，轉(zhuǎn)化率逐漸降低，這是因為高溫在一定程度上會使酶失活.

圖1 W/O值和H2O2濃度對奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應曲面圖Fig.1 Response surface graph of the influence of W/O value and H2O2 concentration on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖2 W/O值和反應溫度對奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應曲面圖Fig.2 Response surface graph of the influence of W/O value and reaction temperature on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖3 H2O2濃度和反應溫度對奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率影響的響應曲面圖Fig.3 Response surface plot of the influence of H2O2 concentration and reaction temperature on the conversion rate of omeprazole sulfide

圖1和圖3顯示，H2O2的濃度對奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率有顯著影響.開始時，轉(zhuǎn)化率隨著濃度的增加而增加，直到濃度達到22 mmol·L-1，奧美拉唑硫醚與H2O2的物質(zhì)的量比為1∶1.1，奧美拉唑硫醚最高轉(zhuǎn)化率達到93.75%，然后隨著濃度的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降.當H2O2濃度過低時，無法滿足奧美拉唑硫醚氧化所需要的量，導致轉(zhuǎn)化率下降；當H2O2濃度過大時，由于過氧化物酶可被H2O2滅活[20]，導致SPP活性受到抑制使得轉(zhuǎn)化率降低.H2O2的氧化作用導致酶中的二硫鍵被破壞和蛋白質(zhì)一級結構喪失[21-23]，從而使酶失活.因此，存在最佳H2O2濃度使得奧美拉唑硫醚轉(zhuǎn)化率最高.采用響應面分析法確定了最佳條件.響應面分析和模型計算得到了最佳工藝條件：W/O值為15.85，H2O2濃度為22.44 mmol·L-1，反應溫度為49.68 ℃.在SPP初始酶活性濃度為3 200 U·mL-1，反應時間為50 ℃的條件下，重復實驗3次，得到的奧美拉唑硫化物的轉(zhuǎn)化率為93.75%，與預測值(93.23%)非常接近，相應的(S)-奧美拉唑的收率和EE分別為91.56%和96.08%，表明SPP具有良好的對映選擇性和較高的熱穩(wěn)定性.

5 結論

(S)-奧美拉唑抑制胃酸的效果優(yōu)于其他質(zhì)子泵抑制劑，而且對胃酸相關性疾病有更好的臨床治療效果[24].采用響應面法優(yōu)化了在CTAB/氯仿/正丁醇/水油包水微乳液中SPP催化奧美拉唑硫醚生成(S)-奧美拉唑的反應條件.當SPP初始酶活性濃度為3 200 U·mL-1時，獲得的奧美拉唑硫醚的轉(zhuǎn)化率、(S)-奧美拉唑收率及e.e.分別為93.75%、91.56%、96.08%.最佳反應條件：W/O值為15.85，H2O2濃度22.44 mmol·L-1，反應溫度為49.68 ℃，建立了響應面模型，其R2為0.997 0，表明該模型對實驗值具有較高的預測精度.該實驗使用游離酶，無法循環(huán)使用，可對酶進行固定化處理，使得酶可以循環(huán)使用，降低成本.

本研究同時證明SPP成本低、對映體選擇性好、熱穩(wěn)定性好，可替代成本較高的HRP用于進行生物催化反應.