劉 瑩，袁 巖，雷霄宇，黃 文，王 益*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

香菇由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高，深受消費(fèi)者喜愛，然而進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，香菇中甲醛超標(biāo)導(dǎo)致的食品安全問題困擾著香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。日本學(xué)者Yasumoto[1-4]、Iwami[5]和Fujimoto[6]等在研究香菇特征風(fēng)味形成機(jī)理的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)香菇可以產(chǎn)生內(nèi)源型甲醛，并且是香菇特征風(fēng)味物質(zhì)酶學(xué)代謝途徑的副產(chǎn)物，半胱氨酸亞砜裂解酶(C-S lyase)是該酶學(xué)代謝途徑中的一種關(guān)鍵酶。

目前，對(duì)香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的研究不夠深入，不能為香菇內(nèi)源型甲醛的調(diào)控提供理論依據(jù)。對(duì)香菇內(nèi)源型甲醛進(jìn)行調(diào)控，必須明確香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的基本酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，獲得足量的半胱氨酸亞砜裂解酶是對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的前提。由于香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的含量較低，一般為1%左右[6]，且半胱氨酸亞砜裂解酶存在于香菇細(xì)胞內(nèi)，常規(guī)靜止浸提方法的提取率較低而且耗時(shí)，容易造成酶活損失。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道利用超聲波技術(shù)提取生物酶具有提取時(shí)間短、原料利用率高、酶不易失活等優(yōu)點(diǎn)[7-11]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析的方法對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。半胱氨酸亞砜裂解酶提取工藝的確定，為深入研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)提供條件，從而為香菇內(nèi)源型甲醛的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所提供；S-甲基-L-半胱氨酸亞砜、2,4-二硝基苯肼 美國(guó)Sigma公司；Tris-base 韓國(guó)Biosharp公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Avanti J-E型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；US3120DH型超聲波清洗器 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；Waring組織粉碎機(jī) 德國(guó)Karl Kolb公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取方法

精確稱取10.0g新鮮香菇于組織搗碎機(jī)中，加入一定量的0.1mol/L的Tris-HCl (pH 7.6) 緩沖液進(jìn)行勻漿處理5min。將勻漿液置于250mL三角瓶中，用超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶，提取液經(jīng)10000×g離心處理之后，取上清液測(cè)定酶活，計(jì)算提取率。

1.3.2 半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活測(cè)定方法及提取率的計(jì)算

半胱氨酸亞砜裂解酶催化S-甲基-L-半胱氨酸亞砜生產(chǎn)丙酮酸，酶活性由丙酮酸的生產(chǎn)量反映[12]。反應(yīng)體系為0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.4)緩沖液2mL、酶液0.2mL、4.0μmol/mL底物0.2mL，在具塞試管中于37℃反應(yīng)5min后立即加入0.4mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，加入1mL 2,4-二硝基苯肼，37℃保溫5min，然后加入5mL 2.5mol/L NaOH溶液，反應(yīng)10min后于520nm波長(zhǎng)處比色。以緩沖液、鈍化酶、底物、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼、NaOH反應(yīng)體系為空白。酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

半胱氨酸亞砜裂解酶提取率/(U/g)＝樣品半胱氨酸亞砜裂解酶活性/香菇質(zhì)量

1.3.3 單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定液料比20：1、提取時(shí)間20min、提取功率96W，固定其他條件，分別考察提取時(shí)間(10、20、30、40、50min)、提取功率(24、48、72、96、120W)和液料比(5：1、10：1、15：1、20：1、25：1)對(duì)香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響。采用超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶時(shí)溫度控制在4℃，提取結(jié)束后于4℃條件下離心處理。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法分析提取時(shí)間、提取功率和液料比對(duì)響應(yīng)值的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

由圖1可知，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，在提取時(shí)間為20min時(shí)達(dá)到最大。20min之后，隨著提取時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。說(shuō)明延長(zhǎng)超聲波處理時(shí)間可以促進(jìn)破碎細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸亞砜裂解酶擴(kuò)散到提取緩沖液中，當(dāng)超聲波處理時(shí)間為20min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸亞砜裂解酶已經(jīng)基本溶出，此時(shí)半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率到達(dá)最大值。過(guò)長(zhǎng)的超聲波處理時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致半胱氨酸亞砜裂解酶的酶結(jié)構(gòu)破壞，半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活性降低，造成其提取率下降[7]。

圖 1 提取時(shí)間對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on C-S lyase extraction

2.1.2 提取功率對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

圖 2 提取功率對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on C-S lyase extraction

由圖2可知，超聲功率由24W增加到96W的過(guò)程中，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率顯著增大，超聲功率達(dá)到96W時(shí)，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率具有最大值；但隨著超聲功率繼續(xù)增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率降低。這說(shuō)明在超聲功率小于96W時(shí)，超聲功率的增強(qiáng)，介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)加速，使半胱氨酸亞砜裂解酶迅速?gòu)募?xì)胞內(nèi)游離出并溶解于提取緩沖液中，隨著空化作用、均勻化作用的加強(qiáng)，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率達(dá)到最大值[13]。超聲功率過(guò)大會(huì)引起體系局部的高溫、高壓，造成酶結(jié)構(gòu)的破壞[14]，降低半胱氨酸亞砜裂解酶的酶活，降低其提取率。

2.1.3 液料比對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率逐漸上升，液料比增加到15：1時(shí)，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率到達(dá)最大值；液料比繼續(xù)增大，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率基本保持不變。這說(shuō)明一定范圍內(nèi)液料比的增大有利于半胱氨酸亞砜裂解酶從破碎細(xì)胞內(nèi)游離擴(kuò)散出來(lái)，當(dāng)液料比達(dá)到一定值時(shí)，細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸亞砜裂解酶的溶出量已經(jīng)達(dá)到最大限，此時(shí)繼續(xù)增大液料比，對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率影響不大。過(guò)大的液料比會(huì)造成后續(xù)分離純化半胱氨酸亞砜裂解酶時(shí)能源和試劑的浪費(fèi)，不利于實(shí)際操作[15]。

圖 3 液料比對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on C-S lyase extraction

2.2 超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為優(yōu)化單因素試驗(yàn)得到的工藝條件，以提取時(shí)間、提取功率和液料比為因素，采用Box-Benhnk設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平編碼、試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental trails and results for response surface analysis

2.2.2 因素與提取率模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得自變量與半胱氨酸亞砜裂解酶提取率(Y)的回歸方程：Y＝49.0881＋0.6848A＋2.3249B－0.2868C＋0.2169AB＋0.2763AC＋0.7442BC－0.2094A2－7.5598B2－2.0315C2。

由表2可以看出，該回歸模型P＜0.0001，回歸模型達(dá)到極顯著，失擬項(xiàng)P＝0.1640＞0.05，不顯著；回歸模型因變量和自變量之間的關(guān)系顯著(R2＝0.9944)，說(shuō)明模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小?？梢岳迷摲匠太@得最佳提取工藝條件。分別對(duì)該方程各自變量(A、B、C)求極值，得到極值點(diǎn)為A＝0.1627，B＝0.1548，C＝0.0282，即提取時(shí)間21.63min、提取功率99.72W、液料比15.14：1(mL/g)。在此最優(yōu)條件下，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率為49.37U/g。參考實(shí)際操作以及超聲波儀器功率選擇，將優(yōu)化后的工藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，半胱氨酸亞砜裂解酶的平均提取率為48.76U/g，與理論值基本相符，說(shuō)明回歸模型能較好地預(yù)測(cè)超聲波輔助法提取半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率，優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。采用常規(guī)靜止浸提法，提取時(shí)間為60min，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，半胱氨酸亞砜裂解酶的平均提取率為26.21U/g。結(jié)果表明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率提高了86.04%。

表 2 回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the developed regression equation

由表2可知，超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的工藝參數(shù)中，影響提取率的各因素的主效應(yīng)關(guān)系為提取功率＞提取時(shí)間＞液料比，其中提取功率(B)和提取時(shí)間(A)達(dá)到極顯著水平，液料比(C)沒有顯著性。

2.2.3 交互作用分析

響應(yīng)面圖能比較直觀的反映各因素之間的交互作用，通過(guò)多元回歸方程做響應(yīng)面圖，超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶工藝中提取時(shí)間、提取功率和液料比之間的交互作用對(duì)提取率的影響如圖4所示。

由圖4a可知，提取功率的等高線比提取時(shí)間的等高線排列密集，表明提取功率的主效應(yīng)大于提取時(shí)間，提取時(shí)間的拋物線坡度趨于平緩，對(duì)響應(yīng)值的影響不大，交互作用不顯著。考慮到提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成半胱氨酸亞砜裂解酶酶活下降，可以將提取時(shí)間控制在20min左右。

由圖4b可知，提取時(shí)間和液料比的響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，等高線排列疏松且趨向于圓形，表明提取時(shí)間和液料比的交互作用不顯著，這與統(tǒng)計(jì)結(jié)果相一致(PAC＝0.3275＞0.05)。由于液料比對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率影響不大，過(guò)大的液料比不利于下一步對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶進(jìn)行分離純化，因此，可以選擇較低的液料比進(jìn)行提取。

圖 4 兩因素交互作用對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響Fig.4 Response surface of the effect of two factors on C-S lyase extraction

由圖4c可知，提取功率和液料比的響應(yīng)面坡度陡峭，等高線排列緊密且趨向于橢圓，表明提取功率與液料比的交互作用顯著[16]。液料比在較低水平時(shí)，提取功率的響應(yīng)拋物線的最高點(diǎn)也在較低水平，此時(shí)，提取功率對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率的影響不明顯；隨著液料比的增大，提取功率的響應(yīng)拋物線的最高點(diǎn)在較高水平，此時(shí)提取功率對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率的影響比較明顯。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，該方法有利于半胱氨酸亞砜裂解酶從細(xì)胞中充分溶出，從而顯著提高了香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率，縮短了提取時(shí)間。該方法可以快速、高效地提取出香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶，為進(jìn)一步分離純化該酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)和酶分子結(jié)構(gòu)提供了條件，為通過(guò)酶分子進(jìn)化工程手段調(diào)控香菇內(nèi)源型甲醛提供理論依據(jù)。

為進(jìn)一步優(yōu)化超聲波輔助法提取香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的工藝，本實(shí)驗(yàn)考察了提取時(shí)間、提取功率和液料比3個(gè)因素對(duì)半胱氨酸亞砜裂解酶提取率的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出各因素對(duì)提取率的影響從大小依次為提取功率＞提取時(shí)間＞液料比。最終確定提取工藝條件為提取時(shí)間21.5min、提取功率100W、液料比15：1(mL/g)，在此最佳工藝條件下，香菇中半胱氨酸亞砜裂解酶的提取率為48.76U/g，比常規(guī)靜止浸提法提高了86.04%。

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