林建城,吳建洪,林娟娟

( 莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生態(tài)環(huán)境及其信息圖譜福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 莆田 351100 )

有機(jī)溶劑對(duì)近海水生生物的生長(zhǎng)構(gòu)成了嚴(yán)重危害,受到越來(lái)越多的關(guān)注[1]。二甲亞砜作為“萬(wàn)能溶劑”被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,其排放量與日俱增,可能會(huì)對(duì)近海海域造成污染。二甲亞砜在近海海域海水中已有廣泛分布,其主要來(lái)自浮游植物的釋放,以溶解態(tài)和顆粒態(tài)兩種形態(tài)存在[2-3],東海和黃海冬季海水中溶解態(tài)和顆粒態(tài)的二甲亞砜濃度分別為(10.10±7.54) nmol/L和(8.72±7.80) nmol/L[3]。王英紅等[4]研究表明,2×10-7%二甲亞砜可使斑馬魚(yú)(Daniorerio)受精卵24、48 h及72 h孵化率顯著降低,低含量二甲亞砜對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育以及成魚(yú)生殖可產(chǎn)生影響。二甲亞砜溶劑除了對(duì)環(huán)境中生物直接產(chǎn)生毒性作用外[4-5],近年來(lái),二甲亞砜對(duì)節(jié)肢動(dòng)物和昆蟲(chóng)類N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的影響也得到較多關(guān)注。龔敏等[6]研究顯示,二甲亞砜溶液可導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性下降,2.0 mol/L的二甲亞砜可使該酶活性喪失71.64%;張繼平等[7]研究了二甲亞砜溶液對(duì)鋸緣青蟹(Scyllaserrata)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活作用,當(dāng)二甲亞砜濃度達(dá)到 4.0 mol/L時(shí),酶活性可喪失97%,并建立了酶在二甲亞砜溶液中失活作用的動(dòng)力學(xué)模型。相似的,二甲亞砜對(duì)昆蟲(chóng)類黃粉蟲(chóng)(Tenebriomolitor)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性也可產(chǎn)生抑制作用,隨著二甲亞砜濃度增大,酶活性呈逐漸下降趨勢(shì)[8]。可見(jiàn),當(dāng)生物體處于二甲亞砜溶劑環(huán)境中,體內(nèi)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的生理生化會(huì)受到較大影響。

中國(guó)鱟(Tachypleustridentatus)是生活在近海的一種節(jié)肢動(dòng)物,人為的捕殺和近海日趨嚴(yán)重的污染,對(duì)其生存產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅,屬于瀕危物種。在中國(guó)鱟生長(zhǎng)發(fā)育周期中要經(jīng)歷多次蛻殼,蛻殼是中國(guó)鱟的重要生理現(xiàn)象,蛻殼一次中國(guó)鱟會(huì)較大幅度生長(zhǎng)一次。Zou等[9]研究表明,節(jié)肢動(dòng)物周期性蛻殼生理與其內(nèi)臟或外殼膜的幾丁質(zhì)酶生理生化密切相關(guān);而黃乾生等[10]研究認(rèn)為,凡納濱對(duì)蝦的蛻殼生長(zhǎng)發(fā)育與蝦肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶密切相關(guān)。目前認(rèn)為幾丁質(zhì)酶至少由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶及具外切酶性質(zhì)的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶3個(gè)不同組分組成,中國(guó)鱟消化道具有較高的內(nèi)、外切幾丁質(zhì)酶活性,而且鱟幾丁質(zhì)酶還易受pH、溫度、金屬離子等環(huán)境因素的影響[11-12]。因此,有機(jī)污染物也可能通過(guò)調(diào)節(jié)海洋生物幾丁質(zhì)酶活性,從而對(duì)其生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育直接產(chǎn)生影響。目前尚未見(jiàn)關(guān)于二甲亞砜對(duì)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性影響的報(bào)道。筆者擬探討二甲亞砜溶劑對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響,闡明二甲亞砜對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理和抑制作用類型,揭示該酶在二甲亞砜溶劑中酶活性和酶分子構(gòu)象之間的構(gòu)效關(guān)系,為二甲亞砜可能直接對(duì)中國(guó)鱟蛻殼生理產(chǎn)生影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從莆田市城南市場(chǎng)某采購(gòu)者贖回一已宰殺過(guò)的中國(guó)鱟,作為試驗(yàn)材料。參照文獻(xiàn)[12]的方法分離純化中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶,分別通過(guò)30%和80%飽和度(NH4)2SO4沉淀分級(jí)分離、葡聚糖凝膠柱Sephadex G-200層析以及離子交換柱DEAE-32層析,獲得酶制劑,雙蒸餾水透析后經(jīng)聚丙烯凝膠酰胺電泳PAGE和SDS-PAGE檢定酶的純度,純酶制劑用于試驗(yàn)研究。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化試劑Sephadex G-200是Pharmacia產(chǎn)品,纖維素DE-32來(lái)自Whatman,對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、二甲亞砜等藥品與試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影響

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性參照文獻(xiàn)[12-13]的方法測(cè)定。2 mL酶測(cè)活體系中包含:0.5 mmol/L 對(duì)硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷底物0.2 mL,0.15 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖體系(pH 5.4)1 mL,雙蒸水 0.78 mL,20 μL純酶。在37 ℃下催化反應(yīng)10 min,以0.5 mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng),設(shè)立空白對(duì)照,在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液光密度[D(405 nm)]。此條件下,每分鐘催化底物反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol/L對(duì)硝基酚所需的酶量定義為1酶活性單位(U)。

在上述測(cè)活體系中,加入不同濃度二甲亞砜溶劑,測(cè)定酶經(jīng)二甲亞砜作用后的剩余酶活性,研究二甲亞砜對(duì)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次,采用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.2 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理

在測(cè)活體系中,底物濃度(cS)不變,改變N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度(ρE),分別測(cè)定不同濃度二甲亞砜溶劑對(duì)酶活性的影響,酶促反應(yīng)速率(v)以酶活性大小表示,以v對(duì)ρE作圖,分析二甲亞砜溶劑對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理。

1.2.3 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用類型

采用Lineweaver-Burk作圖法。在測(cè)活體系中,N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶質(zhì)量濃度不變,改變底物濃度(0.20～0.80 mmol/L),分別測(cè)定不同濃度二甲亞砜溶劑對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影響,以測(cè)定的1/v對(duì)1/cS作圖,計(jì)算二甲亞砜溶劑作用下酶的米氏常數(shù)(Kmapp)和最大反應(yīng)速率(vmapp),分析二甲亞砜對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用類型;以上述各直線斜率(y)對(duì)相應(yīng)的二甲亞砜濃度(x)作圖,求得抑制常數(shù)(KI)。

1.2.4 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶空間構(gòu)象的影響

測(cè)定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶經(jīng)不同濃度二甲亞砜溶劑作用后的紫外吸收光譜,分析N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜溶劑中的紫外吸收光譜變化規(guī)律;此后,在232.2 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光譜下,測(cè)定經(jīng)不同濃度二甲亞砜溶劑作用后中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射光譜。根據(jù)蛋白的光譜吸收特征及其變化規(guī)律,分析二甲亞砜溶劑對(duì)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶空間構(gòu)象的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)鱟內(nèi)臟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分離純化

分離純化后獲得的中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制劑,經(jīng)PAGE和SDS-PAGE鑒定,電泳圖譜均顯示一蛋白譜帶(圖1),說(shuō)明經(jīng)分離純化后N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶已達(dá)到電泳純,可用此純酶制劑進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的PAGE(a)及SDS-PAGE(b)圖譜Fig.1 PAGE(a) and SDS-PAGE (b) of the purified N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) from T. tridentatus

2.2 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響

中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜溶劑中呈現(xiàn)失活現(xiàn)象(圖2),隨著二甲亞砜濃度的升高,酶活性逐漸下降,呈明顯的濃度效應(yīng),0.1 mol/L二甲亞礬可使中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性下降38.0%,導(dǎo)致酶活性喪失50%的二甲亞砜濃度(IC50)為0.21 mol/L,在5 mol/L二甲亞砜溶劑中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶幾近失活。

圖2 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Effect of dimethyl sulfoxide on the activity of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from T. tridentatus

2.3 二甲亞砜溶劑對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的判斷

試驗(yàn)結(jié)果表明,以N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶經(jīng)不同濃度二甲亞砜作用后的剩余酶活性v對(duì)ρE作圖,得到了5條直線,經(jīng)t檢驗(yàn)分析,同一酶質(zhì)量濃度下,各試驗(yàn)組酶活性之間均存在極顯著差異(P<0.01) (圖3);同時(shí),各直線在坐標(biāo)軸上經(jīng)過(guò)同一原點(diǎn),隨二甲亞砜濃度增大,各直線的斜率(k)逐漸變小,說(shuō)明經(jīng)二甲亞砜溶劑作用后N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的催化效率降低,但有效酶量不變。而只有酶的測(cè)活體系中加入的是可逆抑制劑時(shí),在抑制劑濃度恒定下,酶活性會(huì)按比例受到抑制,從而得到一條斜率較低的直線,隨著抑制劑濃度增大,直線斜率減小[14]。據(jù)此可以判斷二甲亞砜溶劑對(duì)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的失活作用是可逆的,這與二甲亞砜對(duì)凡納濱對(duì)蝦[6]和鋸緣青蟹[7]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理的試驗(yàn)分析與判斷結(jié)果一致。

圖3 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制機(jī)理的判斷Fig.3 Determination of the inhibitory mechanism of dimethyl sulfoxide on N-acetyl-β-D-glucosaminidase from T. tridentatus直線0～4, 二甲亞砜濃度分別為0、0.15、0.30、0.45、0.65 mol/L;同列中標(biāo)有不同大寫(xiě)字母的數(shù)值間差異極顯著(P<0.01).Concentrations of dimethyl sulfoxide for curves 0—4 were 0, 0.15, 0.30, 0.45 and 0.65 mol/L, respectively; means with different capital letters in the same column are very significant differences(P<0.01).

2.4 二甲亞砜溶劑對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制作用類型的判斷

通過(guò)Lineweaver-Burk作圖,獲得了5條直線,并在第二象限同時(shí)相交于一點(diǎn)(圖4)。結(jié)果顯示,隨著二甲亞砜溶劑濃度升高,各相對(duì)應(yīng)的直線斜率也逐漸增大,各直線在x軸的截距逐漸減小,而在y軸上的截距隨著二甲亞砜濃度的增大而增大,說(shuō)明不同二甲亞砜濃度下N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的Kmapp和vmapp均發(fā)生變化,隨著二甲亞砜濃度升高,酶的vmapp逐漸減小,Kmapp反而逐漸增大,表明N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜微擾下,削弱了底物與酶之間的親和力,降低了酶的催化效率?？膳袛喽讈嗧咳軇?duì)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制效應(yīng)是屬于競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合型抑制機(jī)制。

圖4 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk關(guān)系Fig.4 Lineweaver-Burk plots for inhibitory effect of dimethyl sulfoxide on the activity of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from T. tridentatus直線0～4,二甲亞砜濃度分別為0、0.15、0.30、0.45、0.65 mol/L.Concentrations of dimethyl sulfoxide for curves 0—4 were 0, 0.15, 0.30, 0.45 and 0.65 mol/L, respectively.

以圖4各直線斜率(k)對(duì)相應(yīng)二甲亞砜濃度作圖,獲得1條交于第二象限x軸的直線(圖5a):y=0.215x+0.043,在x軸的交點(diǎn)值即是二甲亞砜溶劑對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)(KI),KI為0.200 mol/L;類似地,求出圖3中各直線在y軸的截距,以各截距對(duì)相應(yīng)二甲亞砜濃度作圖,獲得1條直線(圖5b):y=0.095x+0.101,其在橫坐標(biāo)的交點(diǎn)即為二甲亞砜對(duì)酶-底物中間絡(luò)合物(ES)的抑制常數(shù)(KIS),KIS為1.063 mol/L;KI

圖5 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制常數(shù)的測(cè)定Fig.5 The determination of inhibition constants of dimethyl sulfoxide on the N-acetyl-β-D-glucosaminidase from T. tridentatus

2.5 二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶空間構(gòu)象的影響

中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在275 nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰,在0.15 mol/L二甲亞砜溶液作用下酶蛋白的紫外吸收值得到較大幅度提高,后隨二甲亞砜濃度的增大,酶蛋白的紫外吸收值增幅有所減小,但達(dá)到峰值的波長(zhǎng)不變(圖6),說(shuō)明二甲亞砜存在時(shí)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白的共價(jià)結(jié)構(gòu)并未受到破壞,其分子構(gòu)型沒(méi)有發(fā)生改變。酶蛋白的紫外生色基團(tuán)主要來(lái)自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸,本試驗(yàn)中二甲亞砜引起中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白紫外吸收值升高的現(xiàn)象,可能是由于二甲亞砜溶液改變了酶蛋白空間構(gòu)象使得紫外生色基團(tuán)暴露所致。

圖6 中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜中的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectra of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from Chinese horseshoe crab Ta. tridentatus in dimethyl sulfoxide曲線0～4,二甲亞砜濃度分別為0、0.15、0.30、0.45、0.65 mmol/L.Concentrations of dimethyl sulfoxidewere 0、0.15、0.30、0.45、0.65 mol/L for curves 0—4, respectively.

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白在緩沖溶液中的熒光發(fā)射峰在329.1 nm波長(zhǎng)處,酶蛋白經(jīng)二甲亞砜溶劑作用后,其熒光發(fā)射強(qiáng)度出現(xiàn)減弱現(xiàn)象,0.15 mol/L的二甲亞砜溶劑可使酶蛋白熒光強(qiáng)度下降68.0%,而該酶蛋白在0.65 mol/L二甲亞砜中的熒光發(fā)射幾近淬滅(圖7)。但是,二甲亞砜溶劑作用下僅僅改變了N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白的熒光發(fā)射強(qiáng)度,其熒光發(fā)射峰卻基本沒(méi)有位移(圖7),表明加入二甲亞砜溶劑后,中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白分子構(gòu)型基本沒(méi)有改變,只是酶蛋白氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,酶蛋白空間構(gòu)象發(fā)生了變化,從而導(dǎo)致酶的失活作用[14-15]。

圖7 中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜Fig.7 Fluorescence emission spectra of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from Chinese horseshoe crab T. tridentatus in dimethyl sulfoxide solution曲線0～5,二甲亞砜濃度分別為0、0.075、0.15、0.30、0.45、0.65 mol/L.Concentrations of dimethyl sulfoxide were 0、0.075、0.15、0.30、0.45、0.65 mol/L for curves 0—5, respectively.

3 討 論

3.1 二甲亞砜溶劑對(duì)生物酶活性的影響

二甲亞砜溶劑對(duì)不同生物酶的影響存在差異。Sana等[16]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)30%～70%的二甲亞砜溶劑作用10 d后,耐鹽芽孢桿菌酯酶比活性可增加2.25～3.25倍,該酯酶在二甲亞砜中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性;嗜鹽古菌(Haloferaxvolcanii)[17]的嗜鹽醇脫氫酶(ADH2)在二甲亞砜中也具有較好穩(wěn)定性,30%二甲亞砜微擾酶24 h(5 ℃),酶活性還保留有54.0%。然而,Faulds等[18]研究發(fā)現(xiàn),低含量二甲亞砜對(duì)阿魏酸酯酶有促進(jìn)其對(duì)底物水解的作用,當(dāng)二甲亞砜含量大于20%時(shí),酯酶活性開(kāi)始呈下降趨勢(shì);劉永萍等[19]也發(fā)現(xiàn),當(dāng)卵巢癌細(xì)胞CAOV3暴露在1.4%的二甲亞砜中24 h,癌細(xì)胞端粒酶活性有所下降,暴露96 h,端粒酶活性完全受抑制,且表現(xiàn)為可逆的抑制作用;Chen等[20]研究表明,低濃度的二甲亞砜可導(dǎo)致對(duì)蘑菇酪氨酸酶的可逆失活作用,這種失活屬于混合型抑制作用,半抑制濃度為2.45 mol/L。

二甲亞砜對(duì)不同動(dòng)物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶也有不同效應(yīng)。二甲亞砜溶液可導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的可逆失活作用,半抑制濃度為1.2 mol/L;0.24 mol/L二甲亞砜作用下,凡納濱對(duì)蝦N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性還保留有95%,低于該濃度被認(rèn)為是可使用有機(jī)化合物溶劑的濃度[6];而鋸緣青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜溶液中也可產(chǎn)生可逆的失活作用,半抑制濃度為0.75 mol/L[7];二甲亞砜對(duì)黃粉蟲(chóng)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶也有明顯失活作用,半抑制濃度約0.70 mol/L,失活過(guò)程也是可逆的,屬于混合型抑制類型[8]。本試驗(yàn)中,二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶也呈較強(qiáng)的抑制作用,半抑制濃度為0.21 mol/L,18.24 mmol/L二甲亞砜作用下酶活性僅失去5%,二甲亞砜超過(guò)此濃度對(duì)中國(guó)鱟生理將造成較大影響。這些結(jié)果顯示,二甲亞砜對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制效應(yīng)有所差異,但該酶在二甲亞砜溶液中失活機(jī)制均是可逆的失活作用,說(shuō)明這4種不同動(dòng)物來(lái)源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶與二甲亞砜之間的相互作用機(jī)制是一致的,推測(cè)它們的酶活性中心組成可能大致相同。進(jìn)一步比較二甲亞砜對(duì)上述4種不同動(dòng)物來(lái)源N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶半抑制濃度的大小發(fā)現(xiàn),中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的相對(duì)較小,說(shuō)明中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶對(duì)二甲亞砜溶劑較為敏感。

3.2 酶蛋白在二甲亞砜溶劑中空間構(gòu)象的變化

測(cè)定效應(yīng)物作用下酶蛋白光譜的變化規(guī)律,可以判斷其對(duì)酶蛋白空間構(gòu)象的影響。Mangiagalli等[21]研究表明,二甲亞砜對(duì)南極假絲酵母(Candidaantarctica)脂肪酶B有激活效應(yīng),40%二甲亞砜能使酶活性提高66%,而20%和40%二甲亞砜溶劑對(duì)脂肪酶B熒光發(fā)射光譜無(wú)影響,其認(rèn)為二甲亞砜并不影響酶蛋白的構(gòu)象;Mukherjee等[22]研究發(fā)現(xiàn),5%二甲亞砜可使羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)RY1幾丁質(zhì)脫乙酰酶的活性提高2倍多,在1%～5%的二甲亞砜微擾下酶蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射峰值得到提高,但發(fā)射峰值未出現(xiàn)位移現(xiàn)象,其認(rèn)為二甲亞砜微擾下酶的空間構(gòu)象發(fā)生了有利的變化,酶活性得到了提高。然而,二甲亞砜對(duì)綠色木霉(Trichodermaviride)纖維素酶具有極大的抑制作用,二甲亞砜微擾后酶蛋白在276 nm處的紫外吸收峰未發(fā)生變化,熒光發(fā)射峰基本未位移,但熒光發(fā)射強(qiáng)度有所升高,提示二甲亞砜并未大幅度改變纖維素酶的分子構(gòu)型[15]。目前,二甲亞砜溶劑對(duì)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶構(gòu)象的影響尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道,本試驗(yàn)結(jié)果表明:二甲亞砜可使中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的紫外吸收值增強(qiáng),但使得酶的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度減弱,兩者峰值均沒(méi)有位移;二甲亞砜作用濃度達(dá)0.65 mol/L時(shí),酶蛋白熒光強(qiáng)度接近于0,表明二甲亞砜溶劑作用下N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化,但酶蛋白構(gòu)型不變,構(gòu)象變化導(dǎo)致酶失活。

3.3 二甲亞砜對(duì)酶蛋白空間構(gòu)象影響的可能機(jī)制

二甲亞砜對(duì)酶蛋白空間構(gòu)象影響機(jī)制的研究已獲得較大進(jìn)展。目前認(rèn)為,二甲亞砜溶劑微擾后維系酶蛋白構(gòu)象的次級(jí)鍵發(fā)生了變化,空間構(gòu)象呈松散無(wú)序狀態(tài),致使酶蛋白變性失活?？臻g構(gòu)象的破壞可能引起中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶氨基酸殘基中的紫外生色基團(tuán)暴露出來(lái),致使酶蛋白紫外吸收升高。中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶分子在275 nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰,是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸所貢獻(xiàn)的。而酶蛋白的熒光發(fā)射峰主要來(lái)源于色氨酸[14],中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白的熒光發(fā)射峰在329.1 nm處,推測(cè)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的色氨酸殘基應(yīng)該是埋藏于酶分子內(nèi)核疏水區(qū),二甲亞砜溶劑微擾后酶溶液極性降低了,致使π-π*躍遷的能量升高,酶蛋白熒光發(fā)射強(qiáng)度下降[23]。至于二甲亞砜也能使有些酶蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的機(jī)制,可能與酶本身特性有關(guān),黎春怡等[23]發(fā)現(xiàn),二甲亞砜能使胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),酶熒光發(fā)射峰在340 nm處,其認(rèn)為可能是加入二甲亞砜后,改變了胃蛋白酶分子內(nèi)部酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境,從而處于淬滅狀態(tài)的酪氨酸熒光得以恢復(fù),也可能是由于色氨酸與酪氨酸之間的能量傳遞降低,從而使胃蛋白酶的熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

二甲亞砜對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制作用,該抑制作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系,二甲亞砜對(duì)酶的抑制是可逆的,屬于競(jìng)爭(zhēng)性-非競(jìng)爭(zhēng)性混合型抑制作用;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亞砜溶劑中酶蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化,從而導(dǎo)致酶的失活,硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷底物對(duì)二甲亞砜溶劑引起的酶失活效應(yīng)具有保護(hù)作用,底物濃度越大,對(duì)酶的保護(hù)作用越強(qiáng)。此外,海水中極低濃度的二甲亞砜雖未能對(duì)中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶造成直接影響,但中國(guó)鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶對(duì)二甲亞砜是敏感的,二甲亞砜對(duì)該酶可發(fā)揮明顯的抑制作用,這可能會(huì)進(jìn)一步影響中國(guó)鱟的蛻皮,有待于進(jìn)一步探討。