尹芬芬，楊帆帆，謝中藝，王雨柔，黃新祥，生秀梅，張 盈

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

傷寒沙門菌(Salmonellaentericaserovar Typhi，簡稱S.Typhi)是一種寄生在人類腸道的革蘭氏陰性桿菌，屬胞內(nèi)寄生菌，具有嚴(yán)格的宿主特異性，人是其惟一的感染宿主[1].糞口傳播是S.Typhi主要的傳播途徑，S.Typhi通過污染的食物和水源進入機體，經(jīng)消化道感染，最終引起嚴(yán)重的全身系統(tǒng)性疾病，傷寒熱是其典型癥狀，此外還會出現(xiàn)一些其他癥狀，如軀干上出現(xiàn)玫瑰疹、腹痛、腹瀉、肝脾腫大、胃腸出血等[2].

凋亡是由基因調(diào)控的細胞主動性死亡，包括外源性和內(nèi)源性途徑.外源性通路主要是配體和死亡受體結(jié)合募集FADD和caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC，進一步激活caspase-8以及下游caspase-3蛋白，caspase-8是外源性途徑的關(guān)鍵蛋白.內(nèi)源性線粒體通路主要由DNA損傷、毒素等多種因素誘發(fā)線粒體釋放細胞色素c，協(xié)同凋亡蛋白活性因子-1激活caspase-9，進而激活caspase-3、caspase-7，caspase-9是內(nèi)源性途徑的關(guān)鍵蛋白[3]；內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路主要是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失常引起Ca2+紊亂、大量未折疊或錯誤折疊蛋白堆積等引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，特異性激活caspase-12，進而剪切活化caspase-3，誘導(dǎo)細胞凋亡[4].三條通路最終的執(zhí)行蛋白均為caspase-3，caspase-3被認為是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶.

沙門菌感染巨噬細胞后能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，逃避宿主的免疫識別，有利于細菌在宿主內(nèi)更好的存活.S.Typhi感染巨噬細胞后激活TNF-α，通過增加機體活性氧ROS、減少抗氧化物酶SOD產(chǎn)生來介導(dǎo)細胞凋亡，TNF-α和其受體結(jié)合后激活caspase-8、caspase-3介導(dǎo)的外源性凋亡途徑[5]；鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ Secretion System，T3SS)分泌的效應(yīng)蛋白SipA能夠促進RAW264.7細胞中caspase-3的激活，誘導(dǎo)細胞凋亡[6].

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的一員，屬于Ⅱ型跨膜蛋白.TRAIL蛋白和死亡受體4/5(Death receptor，DR4/5)結(jié)合介導(dǎo)的凋亡通路是近些年的研究熱點，外源加入重組TRAIL蛋白或TRAIL受體激動劑能夠誘導(dǎo)乳腺癌、腎癌等腫瘤細胞凋亡，從而起到較好的疾病治療效果[7-8]，TRAIL處理也可以誘導(dǎo)鼠巨噬細胞RAW264.7呈現(xiàn)時間依賴性凋亡[9]；也有研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL蛋白能夠誘導(dǎo)某些正常細胞如人肝細胞、人角質(zhì)細胞等發(fā)生凋亡[10-11].沙門菌感染機體過程中，巨噬細胞是抵抗細菌入侵過程中重要的吞噬細胞，在機體免疫應(yīng)答及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用，沙門菌也進化出相應(yīng)的機制如在巨噬細胞內(nèi)形成含沙門菌的囊泡SCV (Salmonell-containing vacuole)等得以在細胞內(nèi)生存及增殖[12].但是TRAIL凋亡通路在細菌影響巨噬細胞凋亡方面的研究較少.因此，本研究通過S.Typhi感染巨噬細胞來探究沙門菌對巨噬細胞凋亡通路的影響以及TRAIL信號通路在其中發(fā)揮的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株S.Typhi 野生株GIFU10007(以下簡稱為WT)由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈；人髓系白血病單核細胞THP-1購買自上海生科院細胞庫，由本實驗室保存及培養(yǎng).

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑(Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR熒光定量試劑(Vazyme公司)，RPMI1640細胞培養(yǎng)液、佛波酯PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate)、胎牛血清(Gibco公司)，Annexin V FITC/PI凋亡試劑盒(聯(lián)科生物科技公司)，caspase-3、caspase-8、caspase-9抗體(ABclonal生物科技公司)，TRAIL、DR5抗體(Proteintech公司)，RIPA裂解液(上海生工生物工程有限公司).

1.1.3 主要儀器 恒溫搖床、CO2細胞培養(yǎng)箱、核酸檢測儀(Thermo scientific公司)，分光光度計、PCR擴增儀(Eppendorf公司)，定量PCR儀、免疫印跡凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，流式細胞儀(Beckman公司).

1.1.4 引物 實驗中所用引物均由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見表1.

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 將WT接種于2 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基中，置于搖床中37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)過夜作為種子液.次日，按1∶100的比例將種子液轉(zhuǎn)接至20 mL新鮮液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)早期(A600為0.4左右).

1.2.2 細胞培養(yǎng) THP-1細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，按7×105mL-1的細胞密度接種于六孔板中，加入150 μg·L-1PMA誘導(dǎo)48 h，THP-1細胞分化為巨噬細胞.

表1 qPCR特異性引物名稱及序列Tab.1 Specific primer names and sequences used for qPCR

1.2.3 細胞感染 實驗前1 h吸去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌2次后加入新鮮的細胞培養(yǎng)液.按MOI為20∶1的比例感染巨噬細胞，加入WT菌株的時間點記為0 h；細菌感染1 h后，每孔加入100 mg·L-1慶大霉素殺死胞外細菌，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，每孔棄去一半培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至不同時間點.TRAIL抗體處理實驗中細胞分為3組，細菌感染細胞前1 h即未加入細菌時，第1組細胞加入TRAIL抗體，其終濃度為500 μg·L-1，作為實驗組，第2組細胞加入無菌PBS，作為對照組；前2組細胞均加入細菌感染，第3組細胞加入等量新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液，不加入細菌，作為未感染組；感染2 h更換一半新培養(yǎng)液時，補充一半抗體，使其終濃度保持不變.

1.2.4 RNA-seq WT感染THP-1細胞0 h、4 h和26 h時，棄去培養(yǎng)液，無菌PBS洗滌2次，用Trizol法提取細胞RNA，進行轉(zhuǎn)錄組測序.

1.2.5 qPCR檢測凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平 取2 μg RNA，Oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.以β-actin作為內(nèi)參基因，相對定量法檢測凋亡相關(guān)基因的表達水平，對RNA-seq結(jié)果進行驗證.實驗有3次以上生物學(xué)重復(fù).

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 WT感染THP-1細胞0 h、6 h和24 h時收集細胞，Annexin V FITC/PI染色法對細胞進行染色，1 h內(nèi)完成流式細胞儀上機檢測，操作過程嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說明書進行.實驗有3次以上生物學(xué)重復(fù).

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細胞凋亡 WT感染THP-1細胞0 h、6 h、24 h時，棄去培養(yǎng)液，無菌PBS洗滌2次后，加入RIPA裂解液冰上裂解，12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清液進行后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用GraphPad Prism 8.0、SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗.P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗結(jié)果

2.1 qPCR檢測凋亡相關(guān)基因表達水平

取S.Typhi感染THP-1細胞0 h、4 h和26 h后的RNA樣本進行RNA-seq，將4 h和26 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與0 h比較，篩選出與細胞凋亡密切相關(guān)且存在變化的基因(表2).進一步使用qPCR對RNA-seq結(jié)果進行驗證.qPCR結(jié)果顯示caspase-3、caspase-8在4 h表達未有明顯變化，26 h表達水平顯著增加(圖1A、1B)，caspase-9在4 h表達下降，26 h表達水平增加(圖1C)，Tnfsf10(編碼TRAIL蛋白)、Tnfrsf10b(編碼DR5蛋白)、Tnf、Fas在4 h、26 h均出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)錄增加(圖1D～1G).RNA-seq中caspase-9在4 h表達基本無變化，caspase-3、Fas基因26 h表達略有下降，與qPCR結(jié)果存在差異，其余基因驗證結(jié)果與RNA-seq一致.以上數(shù)據(jù)表明TRAIL、TNF、FAS三條外源性凋亡通路在感染早期和后期均發(fā)生不同程度的激活.

注：*:P<0.05，**:P<0.01，ns:P>0.05圖1 qPCR檢測THP-1細胞凋亡相關(guān)基因的表達Fig.1 Expression of apoptosis-related genes in THP-1 cells was detected by qPCR

2.2 S. Typhi誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡

S.Typhi感染THP-1細胞0 h、6 h和24 h后，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況.結(jié)果如圖所示，S.Typhi感染6 h和24 h后，細胞凋亡較未感染(0 h)時明顯增加，24 h細胞凋亡率較6 h也明顯增多(圖2A、2B，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義)，說明S.Typhi能夠誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡，且隨著感染時間的增加，細胞凋亡越明顯.

注：*:P<0.05，**:P<0.01圖2 流式細胞術(shù)檢測THP-1細胞凋亡(A)及其統(tǒng)計結(jié)果(B)Fig.2 Apoptosis rate in THP-1 cells was detected by flow cytometry (A)and its statistical results (B)

凋亡相關(guān)蛋白在細胞凋亡過程中發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，上游caspase蛋白特異性剪切激活下游底物蛋白，進而在細胞凋亡中發(fā)揮作用.通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9剪切條帶的表達水平，結(jié)果如圖3所示，S.Typhi未感染細胞(0 h)時，三個蛋白未發(fā)生剪切活化，細菌感染THP-1細胞6 h和24 h時均檢測到三個蛋白的剪切條帶，24 h caspase-3、caspase-9剪切條帶明顯強于6 h，表明S.Typhi感染細胞后激活外源性、內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)其凋亡，感染后期細胞凋亡明顯增加，此結(jié)果與前述qPCR和流式細胞術(shù)結(jié)果一致.

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測caspase-3、caspase-8、caspase-9剪切蛋白的水平Fig.3 Levels of cleaved caspase-3，caspase-8 and caspase-9 detected by western blot

表2 RNA-seq 凋亡相關(guān)基因表達變化Tab.2 Expression changes of apoptosis-related genes in RNA-seq

2.3 S. Typhi激活TRAIL信號通路

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測S.Typhi感染細胞0 h、6 h和24 h后TRAIL信號通路中死亡配體TRAIL和其受體DR5的表達情況.結(jié)果如圖4所示，S.Typhi未感染細胞(0 h)時TRAIL幾乎不表達，細菌感染后TRAIL的表達顯著增加，DR5蛋白表達水平較未感染時也明顯增加，但未呈時間依賴性.以上結(jié)果表明S.Typhi感染THP-1細胞后能夠誘導(dǎo)TRAIL信號通路的激活.

圖4 蛋白免疫印跡法檢測TRAIL及其受體DR5的蛋白水平Fig.4 Protein levels of TRAIL and its receptor DR5 detected by western blot

2.4 TRAIL抗體處理減少THP-1細胞凋亡

在S.Typhi感染細胞前1 h加入TRAIL抗體(anti-TRAIL Ab)來結(jié)合活化的TRAIL蛋白，另外未加菌感染和加無菌PBS作為對照.S.Typhi感染THP-1細胞6 h時，通過蛋白質(zhì)免疫印跡和流式細胞術(shù)來檢測細胞凋亡情況.實驗結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，加入TRAIL抗體處理后凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切條帶明顯減弱(圖5)，凋亡細胞數(shù)量也明顯下降(圖6A、6B，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義).以上結(jié)果表明TRAIL抗體通過結(jié)合活化的TRAIL蛋白，一定程度上阻斷了TRAIL凋亡通路的激活，進而減少細胞凋亡的發(fā)生，進一步證實了S.Typhi能夠激活TRAIL信號通路，且TRAIL信號通路在S.Typhi誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡過程中發(fā)揮著一定的作用.

注：未感染組為未加S.Typhi感染，為陰性對照；PBS為S.Typhi感染細胞前1 h加入無菌PBS，為對照組；anti-TRAIL Ab為S.Typhi感染細胞前1 h加入TRAIL抗體，為實驗組.圖5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測TRAIL抗體處理后caspase-3的剪切水平Fig.5 Level of cleaved caspase-3 after TRAIL antibody treatment detected by western blot

注：未感染組為未加S.Typhi感染，為陰性對照；PBS為S.Typhi感染細胞前1 h加入無菌PBS，為對照組；anti-TRAIL Ab為S.Typhi感染細胞前1 h加入TRAIL抗體，為實驗組；*:P<0.05，**:P<0.01.圖6 流式細胞術(shù)檢測TRAIL抗體處理后THP-1細胞凋亡變化(A)及其統(tǒng)計結(jié)果(B)Fig.6 Apoptosis rate changes in THP-1 cells after TRAIL antibody treatment detected by flow cytometry (A)and its statistical results (B)

3 討論

S.Typhi感染每年可引起2 000多萬病例，導(dǎo)致40多萬人死亡[13]，在人口密度大、醫(yī)療衛(wèi)生落后的國家和地區(qū)，S.Typhi感染仍然是值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[14].S.Typhi屬于糞口傳播致病菌，進入機體后突破胃酸屏障，粘附并入侵小腸上皮細胞，而后被巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等免疫細胞吞噬，在胞內(nèi)生存增殖，引起全身系統(tǒng)性感染.

沙門菌感染機體過程中巨噬細胞是其重要的宿主細胞.沙門菌可以抑制巨噬細胞凋亡，有利于細菌在宿主內(nèi)更好的增殖和生存，也可以誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，逃避機體的免疫識別，同時將凋亡細胞作為載體擴散到全身，造成機體的持續(xù)性感染.

沙門菌感染細胞后抑制細胞凋亡已有相關(guān)文獻報道.沙門菌T3SS-1分泌的效應(yīng)蛋白AvrA具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，通過乙?；种平z裂原活化蛋白激酶4/7(MKK4/7)水平的JNK通路激活，進而對細胞凋亡發(fā)揮抑制作用.鼠傷寒沙門菌感染小鼠腸上皮IEC6細胞、骨髓來源的巨噬細胞時，AvrA能夠抑制其凋亡，AvrA缺陷可引起全身細胞因子反應(yīng)強烈、上皮細胞及巨噬細胞凋亡增加[15].沙門菌感染細胞后也可以誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，逃避機體的免疫識別，減少炎癥反應(yīng).沙門菌T3SS-1分泌的雙功能效應(yīng)蛋白SipA能夠促進宿主細胞肌動蛋白聚合，在鼠傷寒沙門菌感染RAW264.7細胞早期激活caspase-3，誘導(dǎo)細胞凋亡[6]；S.Typhi感染巨噬細胞后TNF-α和其受體結(jié)合激活caspase-8、caspase-3介導(dǎo)外源性途徑誘導(dǎo)細胞凋亡.

本研究結(jié)果和文獻報道[5]一致，檢測到Tnf、caspase-3、caspase-8轉(zhuǎn)錄水平和caspase-3、caspase-8蛋白水平表達上調(diào)，說明外源性途徑在凋亡過程中發(fā)揮了重要作用.然而文獻[5]中S.Typhi感染THP-1細胞8 h后未檢測到caspase-9的增加，加入caspase-9抑制劑后細胞凋亡未發(fā)生明顯變化，認為caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑不參與凋亡過程，本研究中卻檢測到細菌感染細胞26 hcaspase-9表達顯著增加，感染6 h和24 h caspase-9剪切條帶明顯增強，猜測可能是caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑在細胞凋亡過程中發(fā)揮的作用弱于外源性途徑，以至于加入caspase-9抑制劑未對細胞凋亡產(chǎn)生較大的影響.此外，文獻[5]中通過S.Typhi標(biāo)準(zhǔn)菌株感染巨噬細胞8 h使用比色法檢測caspase-9含量，其MOI感染比例、感染時間、檢測方法以及所使用菌株均與本研究不同，這些因素對結(jié)果存在差異也產(chǎn)生一定影響.

本研究中，S.Typhi感染細胞早期，THP-1細胞凋亡發(fā)生較弱，可能感染前期細菌表達的組分如莢膜多糖等或分泌的效應(yīng)蛋白能夠抑制巨噬細胞凋亡，從而保證細菌在巨噬細胞內(nèi)進行大量增殖；隨著感染時間增加，細胞凋亡逐漸增強，這也使得在感染后期，胞內(nèi)增殖的細菌可以釋放至細胞外，繼而引起持續(xù)性和系統(tǒng)性感染.

TRAIL屬于Ⅱ型跨膜蛋白，C端在胞膜外，N端在胞膜內(nèi)，在特異性蛋白酶作用下，TRAIL蛋白胞外區(qū)域被剪切為可溶性分子存在于細胞外液中，TRAIL蛋白和DR4/5介導(dǎo)的外源性凋亡通路在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡方面已經(jīng)有廣泛研究.TRAIL通過降解sigma1受體激活caspase-8、caspase-3誘導(dǎo)人前列腺細胞凋亡[16]；喹啉和TRAIL協(xié)同作用增強線粒體凋亡通路介導(dǎo)的癌細胞凋亡[8].然而，TRAIL在細菌感染中的作用尚不清楚.TRAIL與受體蛋白的親和力與溫度有關(guān)，37 ℃時TRAIL對DR5表現(xiàn)出極強的親和力，對DR4蛋白的親和力較弱[17]，且RNA-seq中編碼DR4的基因未有明顯變化，因此本研究通過S.Typhi感染THP-1細胞檢測TRAIL及其受體DR5蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)S.Typhi感染巨噬細胞激活細胞TRAIL信號通路，猜測S.Typhi的某種組分如LPS、Vi莢膜多糖、鞭毛蛋白等或細菌分泌的某種效應(yīng)蛋白被宿主細胞識別，細胞接收胞外凋亡信號，促進TRAIL和受體的結(jié)合，激活TRAIL通路介導(dǎo)的凋亡.加入TRAIL抗體結(jié)合剪切活化的TRAIL蛋白阻斷TRAIL信號通路后，發(fā)現(xiàn)細菌誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡作用減弱，再次表明TRAIL通路在細胞凋亡中發(fā)揮著一定作用.

沙門菌LPS激活炎性通路后能夠激活細胞產(chǎn)生外源性刺激物TNF-α等，可以激活TNF通路介導(dǎo)細胞凋亡，LPS還可以上調(diào)細胞中TRAIL的表達誘導(dǎo)細胞凋亡.羊肺炎支原體莢膜多糖誘導(dǎo)氣道上皮細胞凋亡，上調(diào)Fas和FasL蛋白表達，caspase-8剪切條帶增強激活外源性凋亡途徑，促進ROS生成及氧化應(yīng)激，破壞線粒體膜完整性、線粒體膜電位下降，進而激活內(nèi)源性途徑[18].新生隱球菌莢膜多糖激活Fas-FasL通路介導(dǎo)巨噬細胞凋亡，caspase-8直接或通過Bcl2家族蛋白放大凋亡信號間接激活caspase-3[19].沙門菌鞭毛蛋白可以促進原代人巨噬細胞、Jurkat細胞等死亡，以RIP1依賴的方式增加Fas、TNF介導(dǎo)的細胞凋亡[20-21].病原菌通過自身結(jié)構(gòu)組分激活TNF、Fas介導(dǎo)細胞凋亡已有一定的研究，S.Typhi何種組分或效應(yīng)蛋白介導(dǎo)TRAIL通路的激活尚未可知，有待于深入探究和討論.

綜上所述，S.Typhi感染巨噬細胞可誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，且TRAIL通過DR5受體激活外源性信號通路在S.Typhi誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用，本研究對進一步了解沙門菌的致病機制提供了一定的思路.