趙曉玲 商曉慧 詹常森

摘 要 目的：建立健腰密骨片中丹酚酸B 的質(zhì)量控制方法。方法：通過條件摸索，建立復方健腰密骨片中丹酚酸B薄層色譜定性鑒別方法和高效液相色譜定量檢測方法。結(jié)果：制劑中丹酚酸B在薄層層析板上顯示一清晰斑點、且重現(xiàn)性好、專屬性強、陰性對照無干擾。HPLC測定顯示丹酚酸B在0.191～15.291 mg范圍內(nèi)呈良好線性關系，回歸方程為Y=1 190.30X-253.63，r=0.999 9；平均加樣回收率及RSD分別為96.72%和1.46%。 結(jié)論：新建的檢測方法簡便、快速、準確，重復性好，可作為健腰密骨片中丹酚酸B的質(zhì)量控制方法，可以更好地保證制劑的整體質(zhì)量，具有很強的實用性。

關鍵詞 健腰密骨片 丹酚酸B 薄層色譜鑒別 高效液相色譜

中圖分類號：R927.2； R286 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）13-0073-04

Establishment of a quality control method for the determination of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets

ZHAO Xiaoling， SHANG Xiaohui， ZHAN Changsen

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish a quality control method of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets. Methods： A thin-layer chromatography （TLC） method for qualitative identification and an HPLC method for the quantitative determination of salvianolic acid B were established by condition tests. Results： Salvianolic acid B in the preparation showed a clear spot on TLC， which was reproducible and specific without the interference of negative control. The calibration curve of salvianolic acid B by HPLC was linear in the range of 0.191-15.291 μg and regression equation was Y=1 190.30X-253.63， r=0.999 9. The average recovery ratio was 96.72% and the relative standard deviation was 1.46%. Conclusion： The established new methods are simple， rapid， accurate and reproducible and can be used as the quality control of salvianolic acid B in Jianyao Migu tablets and can better guarantee the overall quality of the preparation and has strong practicability.

KEy WORDS Jianyao Migu tablets； salvianolic acid B； thin-layer chromatography； HPLC

健腰密骨片是由上海市名中醫(yī)、上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院施杞教授在繼承石氏傷科“以氣為主、以血為先”理論精髓的基礎上，結(jié)合50多年臨床實踐的經(jīng)驗總結(jié)方，該方由黃芪、淫羊藿、墨旱蓮、丹參等6味中藥組成，具有“益氣健腰補腎，化瘀通絡止痛”的功效。方中黃芪為君藥，補中益氣，利水消腫，標本兼顧。淫羊藿為臣藥，發(fā)揮其補腎壯陽、強筋續(xù)骨、祛風除濕的功效，上述兩味藥在制劑質(zhì)量標準開發(fā)過程中已建立定量檢測質(zhì)量控制標準。

丹參具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神等功效。丹酚酸B為《中國藥典》2015年版一部丹參含量測定項檢測物質(zhì)之一[1-2]。雖然已有很多文獻已對丹參及丹酚酸B的含量測定方法進行研究報道[3-5]，但作為復方健腰密骨片的使藥，其質(zhì)量也應進行檢測以保證復方藥效的穩(wěn)定，從而協(xié)助君、臣藥以加強治療作用，也可直接治療次要兼證。本文通過試驗摸索擬建立健腰密骨片中丹參的薄層色譜鑒別方法和丹酚酸B的高效液相色譜含量測定方法，利用新建立的薄層鑒別方法和含量測定方法完善質(zhì)量標準，為制劑的全方位質(zhì)量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；實驗室專用超純水機（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設備有限公司）；Mettler Toledo AL204天平、Mettler Toledo XS205天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋HHS型（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；真空干燥烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）；超聲機SK-7210HP（上?？茖С晝x器有限公司）。

德國默克硅膠板G60（10 cm×10 cm），購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；丹酚酸B對照品（批號：11562-201716，供含量測定用，含量以94.1%計）和丹參對照藥材（批號：120923-201615，供薄層鑒別用），均購自中國食品藥品檢定研究院；健腰密骨片（批號：S180501、S19110101、S19110102、S19110401、S19110402、S191102）由上海和黃藥業(yè)有限公司提供；乙腈為色譜純試劑（Dikma公司）；水為超純水；磷酸為色譜純試劑；其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 丹酚酸B薄層鑒別

1）薄層鑒別供試品溶液 取健腰密骨片適量，研細，取5 g，加甲醇50 mL，超聲處理（功率350 W，頻率53 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL（乳化層轉(zhuǎn)移至水層），合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為不同批號薄層鑒別供試品溶液1～5。

2）薄層鑒別丹酚酸B對照品溶液 取丹酚酸B對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為薄層鑒別丹酚酸B對照品溶液。

3）薄層鑒別丹參對照藥材和薄層鑒別陰性溶液 另取丹參對照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣以甲醇1 mL溶解作為薄層鑒別丹參對照藥材溶液。按處方比例，除去丹參，按處方制得薄層鑒別丹參陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法，同法制得薄層鑒別丹參陰性溶液。

4）薄層色譜法 取各薄層鑒別受試溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上[2]，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4∶6∶8∶1∶4）為展開劑，預平衡15 min后放入硅膠板，展層后取出，晾干，噴5%三氯化鐵乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

1.2.2 丹酚酸B含量測定

1.2.2.1 色譜條件

Agilent TC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）為流動相，流速1.0 mL/min；檢測波長286 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 mL。

1.2.2.2 溶液制備

1）對照品溶液 精密稱定丹酚酸B對照品（含量以94.1%計）15.94 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，即得每1 mL含0.15 mg的丹酚酸B對照品溶液。

2）供試品溶液 精密稱定健腰密骨片1.5 g，置具塞三角錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL后稱重；超聲提取30 min，放冷，再稱重，用60%甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

3）陰性樣品溶液 按健腰密骨片的處方制得不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液處理方法制備陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 薄層鑒別

薄層鑒別供試品與薄層鑒別丹酚酸B對照品、薄層鑒別丹參對照藥材在薄層色譜的相同位置顯示相同顏色的斑點，而薄層鑒別丹參陰性對照無斑點，表明陰性對照對薄層色譜沒有干擾（圖1）。

2.2 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 mL進樣測定，陰性樣品溶液在對照品相同的保留時間處未見色譜峰，說明對色譜測定無干擾（圖2）。

2.3 線性關系考察

分別配制質(zhì)量濃度為19.1、38.2、76.5、152.9、305.8、611.6、1 529.1 mg/mL丹酚酸B溶液，進樣測定峰面積，并以峰面積為縱坐標（Y），以進樣量（mg）為橫坐標（X）繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程為：Y=1 190.30X-253.63 r=0.999 9。結(jié)果表明丹酚酸B在0.191～15.291 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取供試品溶液重復進樣6次，測定峰面積并計算其RSD。結(jié)果丹酚酸B RSD為0.07%，表明該測定方法精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同一批號的健腰密骨片平行制備6份供試品溶液，色譜測定并計算丹酚酸B含量，其平均含量為4.93 mg/mL，RSD為0.84%，表明該方法的重復性良好。

2.6 加樣回收率試驗

精密稱定含量已知的同一批健腰密骨片（批號S180501）樣品9份，按約為樣品丹酚酸B含量的0.8、1.0、1.2倍量分別加入對照品適量，進樣測定并計算回收率，結(jié)果表明平均回收率為96.72%、RSD為1.46（表1）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液置于室溫（25 ℃），分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h進樣測定，記錄丹酚酸B的峰面積。經(jīng)計算其RSD為1.25%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 含量測定

對3批健腰密骨片樣品中的丹酚酸B含量進行測定，結(jié)果表明，丹酚酸B含量相對穩(wěn)定，質(zhì)量可控（表2）。

3 討論

在復方中藥新藥研制過程中，小試研究、中試放大以及向大生產(chǎn)轉(zhuǎn)化時，通常會碰到三個問題：①大生產(chǎn)浸膏得率比小試、中試得率高，導致浸膏粉物料性質(zhì)有差異，影響制劑成型過程和穩(wěn)定性，并影響制劑的制成量，從而影響制劑規(guī)格；②由于大生產(chǎn)是連續(xù)化生產(chǎn)線生產(chǎn)，工藝參數(shù)不同于實驗室，因此需要考慮復方中質(zhì)量標準制定的全覆蓋及合理性；③大生產(chǎn)需要考慮安全、清潔、環(huán)保、節(jié)能和易操作。正因為上述原因，研究并完善復方中的質(zhì)量標準全覆蓋對新藥成果的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化顯得非常必要。

本研究通過調(diào)節(jié)pH使丹酚酸B充分轉(zhuǎn)移至乙醚層，實現(xiàn)快速分離；所建立的薄層鑒別方法比文獻[6-7]操作簡便，可用于復方健腰密骨片中丹參藥材的專屬鑒別；所建立的HPLC含量測定方法所用時間較文獻報道短[8]、流動相配比簡單更具有實用性，具有基本配置的高效液相色譜儀即可滿足測定需求，便于方法轉(zhuǎn)移。在供試品制備方法考察試驗中，曾比較20%、40%、60%和80%甲醇對丹酚酸B提取收率的影響，結(jié)果表明60%甲醇提取收率最高；也試驗了不同提取時間（15、30、45及60 min）對提取收率的影響，結(jié)果顯示30 min能有效提取丹酚酸B，故本試驗選擇60%甲醇超聲提取30 min。

丹酚酸B作為丹參藥材含量檢測的成分之一，已有多年的研究基礎。本研究以復方健腰密骨片為樣品，以使藥丹參質(zhì)量監(jiān)控為目標，建立用于復方制劑質(zhì)量檢測的定性薄層層析鑒別方法和定量HPLC含量測定方法，以便達到復方制劑質(zhì)量可控的目的，為該品種的全方位質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻

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