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        泊洛沙姆188復(fù)驗(yàn)后再使用研究

        2021-08-11 03:52:23張存超胡瀟予任鵬丞
        上海醫(yī)藥 2021年13期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)

        張存超 胡瀟予 任鵬丞

        摘 要 目的:研究泊洛沙姆188復(fù)驗(yàn)期后放置時(shí)間對(duì)其品質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)的影響,為泊洛沙姆188復(fù)驗(yàn)期的確定提供依據(jù)。方法:分別對(duì)復(fù)驗(yàn)期后6個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月的泊洛沙姆188進(jìn)行pH、內(nèi)毒素含量測(cè)定、拉曼鑒別和細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試,評(píng)估其作為培養(yǎng)基組分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:泊洛沙姆188在復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月以內(nèi)的pH、內(nèi)毒素含量和拉曼鑒別符合標(biāo)準(zhǔn),使用復(fù)驗(yàn)期后24個(gè)月以內(nèi)的泊洛沙姆188對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、活率和表達(dá)量與復(fù)驗(yàn)期內(nèi)的無顯著差異,但使用復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月的泊洛沙姆188細(xì)胞生長(zhǎng)和活率及重組蛋白表達(dá)量均降低。結(jié)論:泊洛沙姆188用于無血清培養(yǎng)基組分時(shí),復(fù)驗(yàn)期建議為24個(gè)月。

        關(guān)鍵詞 泊洛沙姆188 細(xì)胞培養(yǎng) 無血清培養(yǎng)基 復(fù)驗(yàn)

        中圖分類號(hào):TQ460.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2021)13-0077-04

        Study on retest period of poloxamer 188

        ZHANG Cunchao, HU Xiaoyu, REN Pengcheng

        (Shanghai Sinomab Biotechnology Co., Ltd., Shanghai 201203, China)

        ABSTRACT Objective: To study the effect of Poloxamer 188 after the retest period on its quality and cell culture. Methods: The determination of pH, endotoxin content and cell culture and the identification of Raman spectra to poloxamer 188 at 6, 24 and 36 months after the retest period were performed to evaluate its effects on cell growth and recombinant protein expression as a medium component. Results: The pH, endotoxin content and Raman identification of poloxamer 188 within 36 months after the retest period met the related standards. Poloxamer 188 within 24 months after retest date showed no differences in cell growth and viability and the protein expression compared with one within retest date, however, those indicators were all decreased when poloxamer 188 stored for 36 months after retest date was used. Conclusion: The retest period of poloxamer 188 is suggested to be 24 months after retest date as a component for serum free medium.

        KEy WORDS poloxamer 188; cell culture test; serum free medium; retest

        無血清培養(yǎng)基是重組蛋白生產(chǎn)中的關(guān)鍵原材料,是影響重組蛋白產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。泊洛沙姆188屬聚氧乙烯和聚氧丙烯的聚合物,是一種無血清培養(yǎng)基中常用的原料,用于培養(yǎng)時(shí)減輕生物反應(yīng)器中攪拌對(duì)細(xì)胞剪切的損傷,通常在常溫條件下保存[1-2]。

        目前,對(duì)培養(yǎng)基的原料管理尚未有明確的標(biāo)準(zhǔn)。一方面,可參考藥用原輔料進(jìn)行管理;另外一方面,培養(yǎng)基有其特殊性,原輔料的檢驗(yàn)指標(biāo)并不能指示原料是否對(duì)無血清培養(yǎng)基使用效果造成影響。

        物料保存時(shí)間一般以有效期或復(fù)驗(yàn)期表示,一般認(rèn)為有效期后不可再進(jìn)行檢驗(yàn),而復(fù)驗(yàn)期后可根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果確定是否可繼續(xù)使用,有效期和復(fù)驗(yàn)期的確定一般基于其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。本研究對(duì)其復(fù)驗(yàn)期進(jìn)行檢查,以確定其作為無血清培養(yǎng)基組分使用時(shí)的復(fù)驗(yàn)指標(biāo)及復(fù)驗(yàn)期,建立適合無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)使用的標(biāo)準(zhǔn)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        泊洛沙姆188購(gòu)自巴斯夫中國(guó)有限公司,批號(hào)分別為GNC11021B(復(fù)驗(yàn)期2021-04-19)、WPmL511D(復(fù)驗(yàn)期2019-09-17,超過復(fù)驗(yàn)期6個(gè)月)、WPAK527B(復(fù)驗(yàn)期2018-03-08,超過復(fù)驗(yàn)期24個(gè)月)、WPYJ536B(復(fù)驗(yàn)期2017-02-08,超過復(fù)驗(yàn)期36個(gè)月),保存條件均為常溫;無水葡萄糖(批號(hào)201812303)購(gòu)自山東西王藥業(yè)有限公司,保存條件為常溫;#1-16無血清培養(yǎng)基(自制培養(yǎng)基,不含泊洛沙姆188);CHOM-S03無血清培養(yǎng)基(批號(hào)20180903)和CHOM-S04無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基(批號(hào)20180904)由上海邁泰君奧生物技術(shù)有限公司提供,保存在2~8 ℃;葡萄糖測(cè)定試劑盒(批號(hào)90142002-2)購(gòu)自上海卓茵醫(yī)療儀器有限公司,保存在2~8 ℃;鱟試劑購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司;其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

        1379型生物安全柜和ST16R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);Multitron Pro振蕩培養(yǎng)箱(瑞士Infors公司);Vi-cell XR細(xì)胞活力分析儀(美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司,所用試劑包為上海邁泰君奧生物技術(shù)有限公司自研試劑包);Acquity液相色譜(美國(guó)Waters公司);FE28 pH計(jì)、ME802電子天平、ReactRaman 785拉曼光譜儀(瑞士梅特勒-托勒多公司);Absolute A Column(2.0 mm×30 mm,填料粒徑30 mm,加萊克公司);Steritop Quick Release-GP一次性杯式濾器(濾膜孔徑0.22 mm,美國(guó)Merck公司)。

        1.2 方法

        參考《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定對(duì)泊洛沙姆188進(jìn)行pH和細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定及拉曼光譜鑒別[3]。

        1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 稱量#1-16無血清培養(yǎng)基干粉22.7 g四份至四個(gè)燒杯中,分別添加氫氧化鈉2.5 g和純化水800 mL后攪拌1 h,然后添加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至(7.2±0.1),攪拌1 h。添加碳酸氫鈉2 g,攪拌30 min,用純化水定容至1 L。將不同批號(hào)的泊洛沙姆188按1.0 g/L分別加入#1-16中。攪拌30 min后,使用一次性杯式濾器過濾除菌。

        2)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng) 使用RCB-12(表達(dá)一種重組單克隆抗體)作為種子細(xì)胞,于2~8℃、800×g 離心5 min,離心換液后,取細(xì)胞沉淀重懸至上述添加不同泊洛沙姆188的#1-16培養(yǎng)基中,在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速為120 r/min,37 ℃,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%)。培養(yǎng)基添加量為50 mL;初始接種密度0.8×106個(gè)細(xì)胞/mL。從培養(yǎng)第2天開始,每天添加1.5% CHOM-S03和0.15% CHOM-S04補(bǔ)料培養(yǎng)基。添加復(fù)驗(yàn)期內(nèi)泊洛沙姆188的為對(duì)照組,添加其余3批過復(fù)驗(yàn)期的泊洛沙姆188的為實(shí)驗(yàn)組。本研究中各實(shí)驗(yàn)條件各設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣品。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,每天使用細(xì)胞活力分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、按葡萄糖測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定葡萄糖濃度,并補(bǔ)加葡萄糖至濃度為3.0 g/L。

        3)表達(dá)量測(cè)定 培養(yǎng)至第12天結(jié)束,各搖瓶取樣 1.0 mL,按文獻(xiàn)測(cè)定表達(dá)量[4]。取樣用800×g 離心10 min后,取上清液用加萊克Absolute A Column進(jìn)行親和層析純化。收集濾過液,在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度。

        2 結(jié)果

        2.1 泊洛沙姆188檢測(cè)結(jié)果

        結(jié)果顯示,復(fù)驗(yàn)期內(nèi)及復(fù)驗(yàn)期后6~36個(gè)月的泊洛沙姆188在拉曼光譜鑒別、pH和細(xì)菌內(nèi)毒素方面均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        2.2.1 活細(xì)胞密度

        對(duì)比培養(yǎng)前期活細(xì)胞密度變化可知,加入復(fù)驗(yàn)期后6、24個(gè)月的泊洛沙姆188活細(xì)胞密度與復(fù)驗(yàn)期內(nèi)泊洛沙姆188無明顯差異;加入復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月的泊洛沙姆188活細(xì)胞密度從第3天起低于其他實(shí)驗(yàn)組,且第6天最高活細(xì)胞密度比對(duì)照降低了21.4%。在培養(yǎng)后期(第8天后),隨著補(bǔ)料培養(yǎng)基不斷加入,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同復(fù)驗(yàn)期的泊洛沙姆188對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響基本消除(圖1)??傊瑥?fù)驗(yàn)期后6、24個(gè)月的泊洛沙姆188對(duì)細(xì)胞密度無顯著影響,但復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月的泊洛沙姆188可顯著降低活細(xì)胞密度。

        2.2.2 細(xì)胞活率

        加入復(fù)驗(yàn)期后不同時(shí)間的泊洛沙姆188與復(fù)驗(yàn)期內(nèi)的相比,在細(xì)胞培養(yǎng)早期(0~5 d),活率無明顯下降,而第6天開始活率逐漸降低;但與對(duì)照相比,細(xì)胞活率變化趨勢(shì)一致,無明顯差異(圖2)。

        2.2.3 重組蛋白表達(dá)量

        與復(fù)驗(yàn)期內(nèi)泊洛沙姆188相比,加入復(fù)驗(yàn)期后6和24個(gè)月的泊洛沙姆188,其重組蛋白表達(dá)量無顯著差異,但加入復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月的泊洛沙姆188,其重組蛋白表達(dá)量比對(duì)照降低了18.0%(圖3)。

        3 討論

        藥典中對(duì)泊洛沙姆188檢測(cè)進(jìn)行了規(guī)定,包括性狀、鑒別和檢查三方面,側(cè)重于檢查方面的要求,包括酸堿度、溶液的澄清度與顏色、氧乙烯、不飽和度、平均分子量及雜質(zhì)等[3]。然而,泊洛沙姆188作為培養(yǎng)基成分添加到培養(yǎng)基中時(shí),還需考慮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等的影響,這是藥典標(biāo)準(zhǔn)中所缺失的。本研究填補(bǔ)了藥典在這方面的空缺。

        本研究結(jié)果顯示,泊洛沙姆188常溫放置36個(gè)月后,導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)活細(xì)胞密度降低,這可能在長(zhǎng)期放置過程中發(fā)生了在拉曼光譜鑒別中難以反映出的降解,進(jìn)而導(dǎo)致作為培養(yǎng)基組分時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)效果下降,這些降解產(chǎn)物或許可通過一些分析手段進(jìn)行確定[6]。在溶液中,泊洛沙姆188的降解情況取決于溫度、泊洛沙姆188濃度以及緩沖液的組成[7]。根據(jù)阿倫尼烏斯公式(Arrhenius equation,k=Ae(-Ea/RT))[8],溫度降低,反應(yīng)速率也會(huì)降低。因此,泊洛沙姆188作為組分添加到培養(yǎng)基干粉后,其保存溫度由常溫降低至2~8 ℃,反應(yīng)速率也會(huì)發(fā)生一定程度降低,而降低倍數(shù)需經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。本公司對(duì)無血清培養(yǎng)基的穩(wěn)定性研究(數(shù)據(jù)未公開)顯示,無血清培養(yǎng)基干粉在2~8 ℃保存2年以上不影響產(chǎn)品質(zhì)量,即泊洛沙姆188作為組分添加到無血清培養(yǎng)基干粉中保存2年以上,其穩(wěn)定性不會(huì)有明顯變化。

        本研究中,添加復(fù)驗(yàn)期后36個(gè)月泊洛沙姆188時(shí)活細(xì)胞密度降低,其原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,泊洛沙姆188廠家推薦的保存條件為常溫保存,而添加到無血清培養(yǎng)基中之后,作為干粉是2~8 ℃保存。本研究?jī)H對(duì)其常溫的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,然而作為一種組分添加到無血清培養(yǎng)基干粉后是低溫保存的,后續(xù)研究需對(duì)低溫放置的影響進(jìn)行研究。

        本研究是在搖瓶中進(jìn)行,未直接考察泊洛沙姆188在生物反應(yīng)器中的抗剪切作用。然而,使用搖瓶在搖床中培養(yǎng)時(shí),搖床的震蕩也是一種剪切力。在本研究中使用搖床的震蕩代替生物反應(yīng)器中的攪拌進(jìn)行研究,可為后續(xù)在生物反應(yīng)器中的進(jìn)一步研究提供借鑒。

        參考文獻(xiàn)

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